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    應(yīng)用MTT法對惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行規(guī)范化體外藥敏試驗的研究

    2020-03-30 04:00:03李恒善云耀峰梁潤郝靈芳蒼宏宇
    中國實用醫(yī)藥 2020年3期
    關(guān)鍵詞:藥敏試驗惡性腫瘤化療

    李恒善 云耀峰 梁潤 郝靈芳 蒼宏宇

    【摘要】 目的 探究應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法對惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行規(guī)范化體外藥敏試驗的可行性和實用性。方法 30例惡性腫瘤患者的新鮮腫瘤組織, 進行原代細(xì)胞培養(yǎng)純化。采用MTT比色法規(guī)范化檢測12種腫瘤化療藥物對人惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行體外藥敏試驗。結(jié)果 紫杉醇、多西他賽對胃癌和結(jié)直腸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性均為77.78%, 而對乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結(jié)直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環(huán)磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。結(jié)論 MTT法對于臨床合理用藥, 實現(xiàn)腫瘤患者的個體化化療具有重要的價值。

    【關(guān)鍵詞】 四甲基偶氮唑鹽比色法;惡性腫瘤;藥敏試驗;化療

    DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.094

    MTT法為一種用于檢測細(xì)胞生長和存活的方法[1, 2], 主要是通過測定活細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝過程中的脫氫酶將MTT代謝還原為不溶性紫色的甲簪沉淀產(chǎn)物, 而死細(xì)胞不著色[3, 4]。通過MTT染色及個性化篩選, 為臨床更好的使用化療藥物對惡性腫瘤細(xì)胞進行化療治療提供參考依據(jù)。本研究將對MTT法進行系統(tǒng)性的研究?,F(xiàn)報告如下。

    1 資料與方法

    1. 1 一般資料 選取本院2018年6月~2019年5月行初次手術(shù)的30例惡性腫瘤患者作為研究對象。其中, 男22例, 女8例;年齡26~72歲, 平均年齡(52.6±8.87)歲;乳腺癌12例, 胃癌9例, 結(jié)直腸癌9例。

    1. 2 方法

    1. 2. 1 化療藥物的配制 分別選取紫杉醇、多西他賽、阿霉素、表阿霉素、環(huán)磷酰胺、順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、氟尿嘧啶、吉西他濱、長春瑞濱、依托泊苷12種常見化療藥物, 均為臨床用注射針劑, 用腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基配制。配好的實驗藥物置于-20℃保存, 應(yīng)用時需提前放置室溫。

    1. 2. 2 惡性腫瘤組織的取材 選取患者的新鮮腫瘤組織, 取材時應(yīng)避開破潰、壞死及液化部分, 以防污染。每例標(biāo)本應(yīng)于離體后5~20 min內(nèi)取材, 要求標(biāo)本直徑約0.5~1.0 cm, 剩余腫瘤組織用于病理, 取材后經(jīng)無菌生理鹽水沖洗后立即置無菌DHanks液中(保證腫瘤組織濕潤及營養(yǎng))帶回實驗室, 并于30 min內(nèi)進行分離培養(yǎng)。

    1. 2. 3 惡性腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)純化 于超凈工作臺內(nèi)取出標(biāo)本, 去除腫瘤組織周圍的脂肪、血管、纖維和壞死組織, 然后用平衡至常溫的DHank s液漂洗2~3遍至無血跡同時沖去廢棄組織。以手術(shù)刀和眼科剪迅速將標(biāo)本剪碎呈糊狀(大小約為1~2 mm3)。用消化培養(yǎng)法進行原代細(xì)胞培養(yǎng), 加入0.25%的胰蛋白酶, 37℃條件下消化20 min后用含有血清的培養(yǎng)基終止消化, 離心棄去上清, 磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次。

    應(yīng)用振蕩法使細(xì)胞充分散開, 經(jīng)200目(直徑0.76 mm)不銹鋼無菌濾網(wǎng)過濾, 棄去脂肪和較大的未解離組織。將最終收獲的腫瘤細(xì)胞置入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。應(yīng)用腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基在37℃, 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)純化。

    1. 2. 4 惡性腫瘤細(xì)胞MTT法藥敏試驗 將培養(yǎng)純化得到的惡性腫瘤細(xì)胞, 制成細(xì)胞懸液, 調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml待用。本試驗根據(jù)所要檢測的化療藥物種類分為多個治療組, 另設(shè)一個陰性對照組和空白對照組, 每組復(fù)置3孔。具體加樣情況如下:治療試驗組:腫瘤細(xì)胞懸液100 μl/孔+化療藥物10 μl/孔+腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基90 μl/孔(藥物終濃度為體內(nèi)血漿高峰濃度10倍);陰性對照組:腫瘤細(xì)胞懸液

    100 μl/孔+腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基100 μl/孔;空白對照組:腫瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基200 μl/孔;將加好樣的96孔無菌培養(yǎng)板, 置37℃、5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后, 每孔中加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl, 上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 離心棄上清, 再加甲臜溶劑三聯(lián)液100 μl, 于37℃放置過夜, 待甲臜結(jié)晶徹底溶解后, 在酶標(biāo)儀上比色, 測出每孔在波長570 nm波長處吸光度A值。藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率=[1-(治療試驗孔平均A值/陰性對照孔平均A值)]×100%。抑制率>50%為高度敏感, 抑制率30%~50%為中度敏感, 抑制率<30%為耐藥。

    2 結(jié)果

    紫杉醇、多西他賽對胃癌和結(jié)直腸癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性均為77.78%, 而對乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性為88.89%;阿霉素對結(jié)直腸癌、胃癌以及乳腺癌原代培養(yǎng)細(xì)胞的藥物敏感性依次為66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次為77.78%、77.78%、66.67%;環(huán)磷酰胺和順鉑依次為66.67%、88.89%、77.78%;卡鉑依次為55.56%、77.78%、77.78%;奧沙利鉑依次為77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次為77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次為66.67%、77.78%、66.67%;長春瑞濱依次為77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次為66.67%、77.78%、77.78%。見圖1。

    3 討論

    惡性腫瘤治療采取化療方案的個體化一直是臨床工作中的一個難題, 因此, 科研人員不斷經(jīng)過摸索建立了多種腫瘤藥物化療的藥敏檢測方法[5]。MTT法具有多種優(yōu)點, 為目前進行腫瘤藥敏試驗最有效的方法之一[6, 7]。

    MTT法可有效反映腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性, 與臨床療效的相關(guān)性較好。然而, MTT方法也存在局限性, 其尚未有一個公認(rèn)的統(tǒng)一技術(shù)順序[8]。因此, 本研究主要對MTT方法學(xué)進行系統(tǒng)研究, 針對該方法操作的各環(huán)節(jié)如細(xì)胞濃度、受試藥物濃度、細(xì)胞培養(yǎng)時間、MTT培養(yǎng)時間等進行合理優(yōu)化和選擇, 進而確定本實驗室的MTT法規(guī)范化操作流程。通過MTT法對人惡性腫瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞進行規(guī)范化體外藥敏試驗發(fā)現(xiàn), MTT法可較準(zhǔn)確的反映不同腫瘤患者對12種不同腫瘤化療藥物的敏感性差異別, 其檢測結(jié)果與臨床療效具有較好的吻合性。此外, 與以往傳統(tǒng)腫瘤藥敏試驗相比, 本研究在腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)純化方面進行了明顯改進, 可大量減少成纖維細(xì)胞及人體其他正常組織成分對藥敏試驗的干擾, 具有一定創(chuàng)新性。

    綜上所述, 本研究通過MTT法對惡性腫瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)進行規(guī)范化體外藥敏試驗, 確定了該試驗的操作流程。

    參考文獻(xiàn)

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    [5] 姚清深, 俸小平, 秦軍, 等. 大腸癌細(xì)胞的藥敏試驗結(jié)果分析及臨床意義. 腫瘤基礎(chǔ)與臨床, 2007, 20 (2):169-170.

    [6] 李上標(biāo), 裴淑艷, 蔣超, 等. MTT比色法研究應(yīng)用進展. 西北民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 34(3):68-73, 91.

    [7] 張海霞, 方蕓, 葛衛(wèi)紅, 等. 四氮哩鹽法腫瘤藥敏試驗及應(yīng)用. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2005, 25(7):663-664.

    [8] 陳強, 張進華, 陳建庭, 等. 改良MTT藥敏分析在成骨肉瘤個體化治療中的意義. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2011, 19(1):153-155.

    [收稿日期:2019-05-21]

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