黃柏蒼術(shù)湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎鼠模型抗炎作用的研究

楊 虹 羅 干 熊梓汀 李巧玲 陳雄斌 王 勇

痛風(fēng)是由于體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，尿酸排泄減少，體內(nèi)持續(xù)高尿酸狀態(tài)，引起過飽和的尿酸析出沉積于組織或器官的一種非特異炎性反應(yīng)[1]。常累及關(guān)節(jié)，致反復(fù)發(fā)作性的關(guān)節(jié)炎；腎臟引發(fā)慢性腎間質(zhì)性腎炎和尿路結(jié)石等。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床上常表現(xiàn)為突發(fā)的關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛及功能障礙，好發(fā)部位多見于第一跖趾關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)[2]。對于該病的治療中西醫(yī)采取的方式有所不同，西醫(yī)一線用藥主要為秋水仙堿、非甾體消炎藥、激素等，能夠起到迅速控制癥狀的作用，但是同時也存在著一定的弊端，如不良反應(yīng)大，有些患者藥物依賴性差等[3，4]。中醫(yī)藥治療痛風(fēng)在我國已有悠久的歷史，而黃柏蒼術(shù)湯在中醫(yī)藥治療痛風(fēng)中有一定的臨床療效，但其作用機制目前尚不明確[5，6]。本研究通過觀察不同濃度黃柏蒼術(shù)湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療后關(guān)節(jié)腫脹值的動態(tài)變化及治療后關(guān)節(jié)液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的變化，初步探討黃柏蒼術(shù)湯治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的可能機制。

材料與方法

1.藥物與試劑：黃柏倉術(shù)湯的主要組成成分：黃柏10g、蒼術(shù)10g、制天南星10g、桂枝10g、威靈仙15g、防己15g、桃仁10g、紅花10g、龍膽草10g、茯苓15g、萆薢12g[6]。水煎濃縮待用。臨用前用0.8% CMC-Na稀釋。秋水仙堿懸液是由云南昆明制藥集團生產(chǎn)的秋水仙堿片研磨呈粉末狀后溶于蒸餾水形成濃度為0.01mg/ml的混懸液。尿酸購自美國Sigma公司。TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6 ELISA檢測試劑盒均購自深圳欣博盛有限公司。

2.實驗動物：SPF級雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量為200～240g，均為3月齡。所有動物均由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。飼養(yǎng)溫度21～27℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風(fēng)環(huán)境自然調(diào)節(jié)。實驗程序嚴格按照動物管理章程。

3.主要儀器：酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，F(xiàn)A2004B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，移液槍(美國Thermo Fisher Scientific公司)，低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

4.尿酸鈉懸液的制備：稱取80mg尿酸鹽晶體，加入無菌PBS溶液中，制成終濃度為80mg/ml的尿酸鹽混懸液。以上操作均在無菌操作臺中進行。

5.實驗動物的造模與給藥：48只大鼠在開放的實驗環(huán)境下飼養(yǎng)1周后，隨機分為模型組、黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組、秋水仙堿組、正常組，每組各8只大鼠。對各組大鼠進行吸入乙醚麻醉后，在無菌條件下以右踝關(guān)節(jié)外側(cè)后方為穿刺點，除正常組注射PBS外，其余各組均注入50μl 80mg/ml的尿酸鹽混懸液，局部消毒預(yù)防感染。尿酸鹽注射后分別灌喂相應(yīng)的藥物，其中黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組分別為12、6、3g/kg，秋水仙堿組為0.1mg/kg。正常組、模型組灌喂0.9%氯化鈉溶液。每次灌胃2.5ml，每天1次，連續(xù)3天。

6.關(guān)節(jié)腫脹值：分別用游標(biāo)卡尺在6、12、24、48、72h測量6組大鼠注射部位同一部位的直徑。用該部位的直徑代表其關(guān)節(jié)腫脹值。

7.關(guān)節(jié)液炎性因子的測定：給藥3天后對大鼠進行頸脫臼處死，收集注射部位關(guān)節(jié)腔積液。根據(jù)各ELSIA試劑盒說明書的方法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的表達。

8.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料的比較用χ2檢驗；多樣本均數(shù)的比較及均數(shù)的兩兩比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.柏蒼術(shù)湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)腫脹值影響的比較：關(guān)節(jié)腔注射尿酸鹽懸液后，除正常組外，其余5組小鼠均在1h內(nèi)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹值增加的情況，且伴隨有紅、腫、熱，大鼠活動功能受限現(xiàn)象，說明急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型造模成功。模型組、黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組、秋水仙堿組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹值在6、12、24、48h均高于正常組(P<0.05)；在注射后72h正常組的關(guān)節(jié)腫脹值與秋水仙堿組、黃柏蒼術(shù)湯中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而模型組、黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組與正常組間比較均大于正常組(P<0.05)，同時黃柏蒼術(shù)高劑量組和黃柏蒼術(shù)低劑量組關(guān)節(jié)腫脹值顯著小于模型組(P<0.05，表1)。

2.黃柏蒼術(shù)湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6表達的影響：模型組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6均顯著高于其余5組(P均<0.05)。其中，黃柏蒼術(shù)中劑量組、秋水仙堿組的TNF-α、IL-1β表達水平顯著低于黃柏蒼術(shù)高劑量組和黃柏低劑量組(P均<0.05)，與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。IL-8、IL-6的表達水平在黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組、秋水仙堿組、正常組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

表1 5組大鼠不同時間點關(guān)節(jié)腫脹值比較

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP<0.05；與黃柏蒼術(shù)湯高劑量組比較，▲P<0.05；與黃柏蒼術(shù)湯中劑量組比較，&P<0.05

表2 5組大鼠關(guān)節(jié)液中炎性因子的表達水平

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與秋水仙堿組比較，ΔP<0.05；與黃柏蒼術(shù)湯高劑量組比較，▲P<0.05；與黃柏蒼術(shù)湯中劑量組比較，&P<0.05

討 論

急性痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎是一種由尿酸鹽晶體沉積于組織和器官引起的急性非特異性炎性反應(yīng)[7]。本研究造模通過在關(guān)節(jié)腔局部注射尿酸混懸液，人工模擬痛風(fēng)的急性發(fā)作過程，該模型的構(gòu)造可有效的研究和評價急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎藥物治療效果，這主要依據(jù)既往的痛風(fēng)動物模型而選擇[8]。尿酸鹽懸液注射到局部關(guān)節(jié)后首先迅速引起大量單核-吞噬細胞聚集，大量聚集的巨噬細胞逐漸對尿酸鹽進行吞噬[9，10]。同時，單核-吞噬細胞還可以通過合成和分泌炎性細胞因子如IL-1、TNF-α、趨化因子來進一步方法炎性反應(yīng)和組織損傷?；罨Ｊ阶R別受體(pattern recognition receptor，PRR)從而激活體內(nèi)的固有免疫。體內(nèi)的MSU還可以通過激活Toll樣受體及髓樣分化因子88，從而啟動下游的核因子(NF)-κB，進一步促使TNF-α、IL-1β的表達，促進炎癥的級聯(lián)損傷[11，12]。研究發(fā)現(xiàn)，尿酸鹽可通過激活NALP3炎性體進一步加劇痛風(fēng)的炎性反應(yīng)[13～15]。因此機體通過分泌IL-1β誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)，固有免疫激活后會募集大量的炎性細胞如單核細胞、粒細胞等，通過大量產(chǎn)生趨化因子及TNF-α、IL-8、IL-6等炎性因子進一步加劇痛風(fēng)急性發(fā)作部位的炎性反應(yīng)和組織損傷[16]。

本研究顯示，在注射后模型組的大鼠關(guān)節(jié)腫脹值隨著時間的進展呈逐漸減低的趨勢，這與痛風(fēng)自然緩解的過程一致。模型組關(guān)節(jié)腫脹值顯著高于黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)湯低劑量組、秋水仙堿組，且在72h黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)湯低劑量組關(guān)節(jié)腫脹值低于秋水仙堿組、黃柏蒼術(shù)湯中劑量組，該結(jié)果說明了黃柏蒼術(shù)湯治療有效，且存在一定劑量的關(guān)系，因為隨著黃柏蒼術(shù)的劑量改變大鼠的關(guān)節(jié)腫脹組變化并非完全一致，從研究結(jié)果顯示中劑量的結(jié)果較優(yōu)，可能是藥物濃度過高或過低在炎性反應(yīng)某階段會參與炎性因子的產(chǎn)生。

本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6顯著增高，均高于其余5組，該組的目的主要是起到陽性對照，可見本研究造模成功，組間有可比性。其中，黃柏蒼術(shù)中劑量組、秋水仙堿組的TNF-α、IL-1β表達水平顯著低于黃柏蒼術(shù)高劑量組和黃柏低劑量組，可能是由于黃柏蒼術(shù)湯治療痛風(fēng)急性關(guān)節(jié)炎有某一最適劑量，可能秋水仙堿、中劑量湯劑對TNF-α、IL-1β抑制作用更強。IL-8、IL-6的表達水平在黃柏蒼術(shù)高劑量組、黃柏蒼術(shù)中劑量組、黃柏蒼術(shù)低劑量組、秋水仙堿組、正常組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于IL-8、IL-6受到4組試劑的抑制作用相同。具體藥物劑量對不同細胞因子的抑制作用尚不明確，可能與炎性因子在炎癥誘發(fā)緩解的觸發(fā)環(huán)節(jié)不同有關(guān)，還需進一步實驗研究加以證實[17]。

本研究對大鼠進行不同藥物灌胃暫未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，考慮可能是由于研究樣本量較少，也可能是由于未對研究對象進行生化方面的相關(guān)檢測，無法確定有無肝臟、腎臟損傷，但是在實驗過程中各組大鼠活力正常。后期可通過加大樣本量觀察有無藥物不良反應(yīng)。

綜上所述，黃柏蒼術(shù)湯可能通過抑制炎性細胞分泌炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6等，緩解急性炎性反應(yīng)，改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)癥狀。其效果是否與黃柏蒼術(shù)湯的劑量有關(guān)還需要進一步驗證。