亞洲柑橘木虱成蟲和5齡若蟲在感染黃龍病的柑橘上的取食行為及獲菌效率比較

烏天宇, 張旭穎, George A. C. BEATTIE, 岑伊靜,*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室, 廣州 510642; 2. 南方日報, 廣州 510000；3. School of Science and Health, Western Sydney University, Penrith, NSW 2751, Australia)

柑橘黃龍病(huanglongbing)是當(dāng)前全球柑橘產(chǎn)業(yè)上最重要的傳染性病害，有亞洲種、非洲種和美洲種，其病原菌分別為‘CandidatusLiberibacter asiaticus’ (Clas)、‘CandidatusLiberibacter africanus’ (CLaf) 和‘CandidatusLiberibacter americanus’ (CLam)，分布在亞洲、南北美洲、大洋洲和非洲近50個國家和地區(qū)，并且有不斷蔓延的趨勢(Bové, 2006; 江宏燕等, 2018)。黃龍病可以侵染幾乎所有柑橘類植物，發(fā)病初期樹冠上有少部分新梢葉片黃化，呈現(xiàn)明顯的黃梢或斑駁黃化癥狀，隨后病梢下段枝條和樹冠其他部位的枝條陸續(xù)發(fā)病(Batooletal., 2007; 吳定堯, 2010)。黃龍病造成植株壽命減短，果實產(chǎn)量銳減，果品質(zhì)劣，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Bové, 2006, 2014)。亞洲柑橘木虱Diaphorinacitri屬半翅目(Hemiptera)扁木虱科(Liviidae)，我國原稱為“柑橘木虱”，是黃龍病最重要的媒介昆蟲，因此研究其與黃龍病菌之間的互作關(guān)系對防止病菌傳播十分重要。

刺吸電位(electrical penetration graph, EPG)技術(shù)是一種用來研究刺吸式口器害蟲在寄主植物上刺探和取食行為的電生理技術(shù)，能夠準(zhǔn)確記錄昆蟲口針在植物組織中的刺探行為和位置，并將口針在植物組織內(nèi)的取食活動轉(zhuǎn)化為一種可見的電信號(Tjallingii, 1978, 1985; 姜永幸和郭予元, 1994)。Bonani等(2010)和楊成良等(2011)最早利用EPG技術(shù)對柑橘木虱的取食行為開展研究，確定了取食波形與其行為之間的關(guān)系。柑橘木虱產(chǎn)生8種主要的取食波形，依次為非刺探波(np波)、路徑波(A, B和C波)、D波、韌皮部分泌唾液波(E1波)、韌皮部被動吸食波(E2波)以及木質(zhì)部主動吸食波(G波)(楊成良等, 2011)。寄主感染黃龍病顯著影響木虱成蟲的取食行為，而且隨寄主發(fā)病程度的加深，成蟲開始刺吸時間顯著推遲，并會在韌皮部分泌更多的唾液(E1時間延長)以及減少在韌皮部取食(E2時間縮短)等(Cenetal., 2012)。另外，對成蟲在病樹嫩葉、成熟葉和老葉上的取食比較研究發(fā)現(xiàn)，在嫩葉上出現(xiàn)C波(路徑波)的時間顯著長于在成熟葉和老葉上，而出現(xiàn)E2波(韌皮部吸食波)的時間明顯比在成熟葉和老葉上短。此外，木虱在嫩葉上出現(xiàn)E波(韌皮部分泌唾液波E1波和E2波時間之和)和G波(木質(zhì)部吸食波)的比例最低，說明在嫩葉上的適應(yīng)性較差(Luoetal., 2015)。Wu等(2016)使用EPG記錄了帶菌柑橘木虱成蟲在健康酸橘上取食24 h的傳病過程，發(fā)現(xiàn)單頭取食24 h后的傳病成功率為22.6%，成功傳病個體的最短取食時間為88.8 min，最短韌皮部分泌唾液(E1波)時間僅為5.1 min。George等(2017)用EPG比較了木虱成蟲在嫩葉和成熟葉的葉面、葉背的取食行為，發(fā)現(xiàn)韌皮部吸食(E2波)時間在成熟葉上顯著短于在嫩葉上，在葉面顯著短于在葉背，推測為韌皮部周圍的纖維質(zhì)厚壁組織可阻止成蟲取食；隨后，George等(2018)又比較了木虱成蟲以及4和5齡若蟲取食行為的差異，發(fā)現(xiàn)若蟲的取食量顯著多于成蟲，獲菌率顯著高于成蟲。本實驗利用EPG技術(shù)比較木虱成蟲和5齡若蟲在感染黃龍病寄主上的取食行為和獲菌效率的差異，并研究了寄主感染黃龍病對5齡若蟲取食行為的影響，進(jìn)一步揭示木虱的取食行為與傳病的關(guān)系，為通過干擾木虱取食而減少黃龍病傳播提供依據(jù)。另外，也對病原、昆蟲、寄主植物三者之間互作關(guān)系提供重要的生物學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

1.1.1供試植物：健康酸橘Citrusreticulatacv. Sunki來自廣東省博羅縣柑橘研究所，全部植株在EPG實驗前均通過qPCR檢測呈黃龍病陰性。移栽1個月后，長出嫩葉進(jìn)行EPG實驗。

黃龍病酸橘：將華南農(nóng)業(yè)大學(xué)柑橘黃龍病研究室繁育的沙糖橘Citrusreticulatacv. Shatangju的病芽嫁接到健康酸橘上使其感染黃龍病，待酸橘顯癥后摘除病芽，并通過qPCR檢測呈黃龍病陽性。

1.1.2供試蟲源：不攜帶黃龍病菌的柑橘木虱采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)九里香植株上，轉(zhuǎn)移到網(wǎng)室內(nèi)盆栽健康酸橘樹上繁育多代，經(jīng)抽樣檢測確定不攜帶黃龍病菌，選擇成蟲和5齡若蟲進(jìn)行實驗。

1.1.3儀器與試劑：EPG信號放大器(荷蘭Wageningen大學(xué)昆蟲實驗室研制的Giga_4直流型)，附帶銀膠、銅釘、銅絲、金絲、數(shù)字轉(zhuǎn)換器(DI_720, DATAQ Instruments)和分析軟件Stylet v01.20_111011；法拉第籠，使用鋁合金與鐵砂網(wǎng)制作，長×寬×高=120 cm×40 cm×80 cm；實時熒光PCR儀TP800(TaKaRa, Osaka, 日本)。

無水乙醇(99.5%分析純)(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；TIANGEN血液組織DNA提取試劑盒(廣州維寧生物科技有限公司)；OMEGA植物DNA提取試劑盒(廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司)；qPCR引物 (英竣生物工程公司合成)；Bioscience qPCR MasterMix (SYBR Green)(廣州萊德爾醫(yī)療儀器科技有限公司)。

1.2 柑橘木虱刺吸電位測定

測試柑橘木虱成蟲和5齡若蟲在感染黃龍病酸橘植株和健康植株上取食的刺吸電位，每天上午9點開始記錄，記錄時間為10 h，成蟲和若蟲分別重復(fù)測試40頭。刺吸電位測定在室溫下進(jìn)行，昆蟲與電極連接方法參照湯清波等(2011)，正式實驗之前將木虱進(jìn)行2 h饑餓處理，然后用導(dǎo)電性銀膠將金絲粘到木虱胸部背面中央，粘連好后，靜置片刻以保證木虱可以正?；顒雍腿∈?。由于木虱偏好在柑橘葉片背面中脈取食，故將葉片翻轉(zhuǎn)并固定，之后將昆蟲電極連入EPG設(shè)備，植物電極則插在土壤中，整個裝置置于法拉第籠中以屏蔽外界電磁波的干擾，待木虱適應(yīng)、穩(wěn)定后啟動電腦記錄軟件。

1.3 柑橘木虱DNA的提取

使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒單頭提取柑橘木虱成蟲或若蟲的DNA，步驟參考其說明書。獲得的DNA樣本使用紫外分光光度計檢測其濃度，將提取的DNA放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 植物組織DNA提取

采用OMEGA公司E.Z.N.A.TM植物試劑盒提取，步驟參考其說明書，獲得的DNA樣本使用紫外分光光度計檢測其濃度，將提取的DNA放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 柑橘木虱獲菌效率的qPCR檢測

EPG實驗結(jié)束后，將每頭柑橘木虱單獨放置在裝有75%酒精的0.5 mL離心管中保存用于qPCR檢測，得到獲菌效率。實時熒光PCR的引物設(shè)計參考Li等(2006)文獻(xiàn)報道設(shè)計的HLB asf/HLB asr引物對。使用Bioscience qPCR MasterMix(SYBR Green染料法)對柑橘木虱體內(nèi)的柑橘黃龍病菌16S rDNA片段進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以確定柑橘木虱體內(nèi)攜帶病菌的情況。按說明書條件配好反應(yīng)體系，并設(shè)置反應(yīng)條件，之后放入Rotor-Gene RG-3000孔反應(yīng)板上，打開配套運(yùn)行軟件Rotor-Gene 6，反應(yīng)結(jié)束后，保存文件用于確定其對應(yīng)的柑橘木虱或植物是否帶菌。

1.6 數(shù)據(jù)分析

EPG波形判斷方法參考Bonani等(2010)和楊成良等(2011)對亞洲柑橘木虱EPG行為波形定義。本研究重點比較以下4種波形：

(1)C波：表示木虱在尋找取食位點，其口針在表皮與維管束的細(xì)胞間隙中穿刺；

(2)G波：表示木虱在木質(zhì)部主動吸食，口針位于胞外木質(zhì)部內(nèi)；

(3)E1波：表示木虱在向韌皮部篩管分泌水溶性唾液；

(4)E2波：表示木虱在韌皮部被動吸食。

使用PROBE 3.4 軟件(荷蘭瓦赫寧根大學(xué))記錄EPG實驗波形，并按選取的參數(shù)對記錄的波形進(jìn)行分析。將得到的數(shù)據(jù)用SPSS 11.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用獨立樣本t檢驗(independent samplest-test)方法分析不同實驗組木虱波形數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 柑橘木虱成蟲與5齡若蟲在感染黃龍病的酸橘上EPG特征參數(shù)比較

實驗分別得到柑橘木虱成蟲35頭、5齡若蟲32頭有效重復(fù)的數(shù)據(jù)。成蟲與5齡若蟲都在2 h內(nèi)第1次對感染黃龍病的酸橘葉片刺探(第1次刺探時間)，在隨后的1 h左右時間尋找到韌皮部篩管分泌唾液(第1次韌皮部分泌唾液時間)，且分泌唾液時間(韌皮部分泌唾液總時間)相對很短，并開始持續(xù)取食韌皮部營養(yǎng)成分(第1次韌皮部被動取食)；另外，成蟲與若蟲在病樹葉片上不取食的平均總時間(非刺探總時間)分別為315.5和188.5 min，而木虱口針進(jìn)入葉片表皮組織在薄壁組織穿刺尋找取食位點過程(路徑波C總時間)分別需要182.7和138.9 min，但兩組數(shù)據(jù)差異都沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖1: A, B)。結(jié)果表明成蟲與5齡若蟲在尋找到病葉取食位點的過程沒有顯著差異。

圖1 柑橘木虱成蟲和5齡若蟲在感染黃龍病的酸橘上取食EPG特征參數(shù)比較Fig. 1 Comparison of the EPG characteristic parameters between adults and the 5th instar nymphs of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri feeding on Citrus reticulata cv. Sunki infected with huanglongbingE1波Waveform E1: 韌皮部分泌唾液Phloem salivation; E2波Waveform E2: 韌皮部被動吸食Phloem ingestion; E波Waveform E: 韌皮部階段Phloem phase (E1+E2); C波Waveform C: 路徑波Pathway phase; G波Waveform G: 木質(zhì)部主動吸食Xylem ingestion; E1/(E1+E2): 韌皮部分泌唾液時間Duration of phloem salivation/韌皮部階段時間Duration of phloem phase; E/(E+C+G): 韌皮部階段時間Duration of phloem phase/(韌皮部階段時間Duration of phloem phase +路徑波時間Duration of pathway phase+木質(zhì)部主動吸食時間Duration of xylem ingestion). 圖中相同類型數(shù)據(jù)差異顯著性均運(yùn)用獨立樣本t檢驗進(jìn)行檢驗。The significance of difference between data within the same series was tested by the independent samples t-test. nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. 圖2同The same for Fig. 2.

但是，5齡若蟲比成蟲在病樹第1次刺探持續(xù)時間要長(圖1: A)，兩者分別為212.5與79.4 min；韌皮部吸食時間(E2)要更久(圖1: B)，分別為199.1和16.4 min;木質(zhì)部吸食時間(G波總時間)也要更長(圖1: B)，分別為185.6和101.7 min。這兩組數(shù)據(jù)差異都極為顯著(P<0.01)，說明若蟲吸收營養(yǎng)物質(zhì)的時間顯著長于成蟲。

另外，5齡若蟲比成蟲在病樹刺探次數(shù)顯著減少(P=0.002)，若蟲在10 h內(nèi)刺探2.4次，而成蟲刺探了6.2次。雖然5齡若蟲韌皮部吸食(E2波)次數(shù)多于成蟲，但這兩者之間的韌皮部分泌唾液(E1波)次數(shù)差異未達(dá)顯著水平(P>0.05)(圖1: C)。成蟲分泌唾液時間占韌皮部總刺吸時間的比例[E1/(E1+E2)]要稍多些，但兩者之間并未達(dá)到顯著差異水平(P>0.05)；但5齡若蟲韌皮部總刺吸時間占總刺吸時間比例[E/(E+C+G)]顯著高于成蟲(P<0.05)，這說明在同等時間內(nèi)若蟲對韌皮部取食的需求量比成蟲要更大(圖1: D)。

2.2 柑橘木虱成蟲與5齡若蟲在感染黃龍病的酸橘上吸食后獲菌效率比較

經(jīng)qPCR檢測，5齡若蟲在感染黃龍病的酸橘嫩梢上取食10 h后有37.5%(12頭)攜帶病菌，成蟲有20.0%(7頭)攜帶病菌，若蟲獲菌率高于成蟲。

2.3 寄主植物感染黃龍病對柑橘木虱5齡若蟲取食行為的影響

實驗共獲得30頭5齡若蟲在健康酸橘上取食的波形，與30頭在感染黃龍病的酸橘上取食的波形進(jìn)行比較，從圖2(A)可以看出，5齡若蟲在感病植株嫩梢上的第一次韌皮部取食時間要顯著早于在健康植株上(P<0.05)，而且刺探次數(shù)、分泌唾液次數(shù)與韌皮部取食次數(shù)都要顯著少于在健康植株上取食(P<0.05)(圖2: C)，而在分泌唾液總時間與韌皮部取食總時間上兩者沒有顯著差異(P>0.05)(圖2: B)，其他波形參數(shù)也沒有顯著差異(P>0.05)(圖2: A, B, D)，說明寄主感染黃龍病使木虱5齡若蟲更快地開始取食，而且更改取食位點次數(shù)變少、持續(xù)吸食時間變長，即對若蟲的取食是有利的。

3 討論

3.1 柑橘木虱成蟲與5齡若蟲在健康與感染黃龍病的酸橘上的取食行為及其獲菌效率的差異

本研究結(jié)果表明，在相同實驗時間內(nèi)，5齡若蟲在酸橘韌皮部和木質(zhì)部取食的時間長于成蟲，而分泌唾液的時間差異不顯著；另外，5齡若蟲在薄壁組織中的刺探次數(shù)比成蟲少，但韌皮部取食次數(shù)比成蟲要多(圖1)，說明在感染黃龍病的寄主上若蟲的取食量比成蟲大，該結(jié)果與George等(2018)的結(jié)果一致。一般來說，昆蟲的未成熟蟲態(tài)由于生長發(fā)育的需要，取食量要大于成蟲，我們在飼養(yǎng)柑橘木虱的過程中發(fā)現(xiàn)成蟲很少分泌蜜露，但若蟲則會在短時間內(nèi)分泌大量的蜜露，在嫩葉處取食的若蟲會使受害嫩葉無法正常展開，造成畸形甚至枯萎掉落，而成蟲則不會造成如此嚴(yán)重的影響。這些現(xiàn)象也說明柑橘木虱若蟲的取食量大于成蟲。與柑橘木虱不同的是，褐飛虱Nilaparvatalugens的取食量(蜜露分泌量)會隨著齡期而增大，且成蟲取食量要大于若蟲(顧秀慧等, 1987)。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)5齡若蟲和成蟲在感染黃龍病的酸橘上取食10 h后的獲菌率分別為37.5%和20.0%，若蟲明顯高于成蟲。George等(2018)報道，柑橘木虱成蟲和若蟲在帶病植物上飼養(yǎng)42 h后，檢測到58%的若蟲和6%的成蟲攜帶黃龍病菌，即若蟲的獲菌率接近成蟲的10倍。Pelz-Stelinski 等(2010)在實驗室條件下比較了木虱成蟲和若蟲在黃龍病病樹上取食5周后的獲菌率，發(fā)現(xiàn)若蟲的獲菌率為60%～100%，而成蟲的獲菌率僅達(dá)40%。盡管獲菌率有差異，但本研究與上述兩個研究的結(jié)果都證明若蟲的獲菌率明顯高于成蟲。Inoue等(2009)報道，在成蟲期獲菌的柑橘木虱不能傳播黃龍病，在若蟲期獲菌則傳病效率很高，達(dá)66.7%。本研究結(jié)果顯示，同等時間內(nèi)若蟲的取食量較大，這種取食行為的差異可以解釋造成兩者獲菌、傳病效率差異的原因。

圖2 柑橘木虱5齡若蟲在健康與感染黃龍病的酸橘上取食的EPG特征波形參數(shù)比較Fig. 2 Comparison of the EPG characteristic parameters of the 5th instar nymphs of the Asian citrus psyllid Diaphorina citri feeding on healthy and huanglongbing-infected Citrus reticulata cv. Sunki

3.2 寄主感染黃龍病對柑橘木虱若蟲取食行為的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，寄主感染黃龍病對柑橘木虱5齡若蟲的取食是有利的(圖2)。而Cen等(2012)的研究發(fā)現(xiàn)，寄主感染黃龍病增加了柑橘木虱成蟲取食的障礙，表現(xiàn)在口針到達(dá)韌皮部的時間顯著延遲，分泌唾液的次數(shù)顯著增加、時間顯著延長、分泌唾液后不吸食的次數(shù)更多，而吸食的時間顯著縮短，而且這種差異隨寄主發(fā)病程度的增加而增加?？梢娂闹鞲腥军S龍病對木虱成蟲和若蟲取食的影響并不一致，對成蟲的取食不利而且影響較大，造成兩者差異的原因很可能與兩次測定使用的寄主葉片成熟度有關(guān)，成蟲實驗使用的是病苗的成熟葉(Cenetal., 2012)，而由于若蟲僅取食嫩梢，所以本實驗是在嫩梢上進(jìn)行測定。Kunta等(2014)和黃金萍等(2015)的實驗結(jié)果都表明成熟葉片比嫩芽或嫩葉中的黃龍病病原菌濃度高；Luo 等(2015)的研究也說明不帶菌木虱成蟲在病樹成熟葉取食的獲菌率高于嫩葉，這可能是導(dǎo)致黃龍病感染寄主植物對成蟲和若蟲取食行為影響相反的原因之一。

欽俊德(1987)認(rèn)為，阻礙昆蟲取食植物最重要的是植物化學(xué)成分，其次是形態(tài)與結(jié)構(gòu)。黃龍病的侵染會對植物造成不同程度的影響。Kim等(2009)研究認(rèn)為，黃龍病葉片光合作用會因為韌皮部病變，產(chǎn)生的有機(jī)物質(zhì)無法轉(zhuǎn)運(yùn)出去，從而引起淀粉粒積累阻塞柵欄細(xì)胞與薄壁組織。鐘云等(2012)通過SSH文庫建立分析發(fā)現(xiàn)，在黃龍病誘導(dǎo)下椪柑涉及抗逆防御、運(yùn)輸、能量代謝、光合作用等代謝途徑和生理生化過程的基因表達(dá)發(fā)生變化。研究表明，體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)是寄主植物與刺吸式昆蟲互作的信號分子，而生物脅迫的一個早期反應(yīng)便是ROS水平提高(Maffeietal., 2007)，但調(diào)控防御反應(yīng)的能力或者調(diào)節(jié)酶活性的能力在抗性和敏感植株內(nèi)又是不同的(張海靜等, 2012)。推測在本實驗中，由于柑橘樹病變而減弱了葉片對昆蟲的某些防御機(jī)制，使得5齡若蟲能夠在病樹固定位置取食，減少重新選擇取食位點的次數(shù)，而由于病樹嫩葉中的韌皮部阻塞還未達(dá)到影響木虱取食的閾值，所以病樹的嫩葉結(jié)構(gòu)并沒有對5齡若蟲造成取食障礙，也沒有影響其對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收量。這個結(jié)果與Alvarez等(2007)對在健康和感染馬鈴薯卷葉病毒(potato leafroll virus, PLRV)的馬鈴薯上取食的桃蚜Myzuspersicae研究結(jié)果相似：在被PLRV感染的馬鈴薯葉片上取食的桃蚜，其刺探次數(shù)、F波(機(jī)械障礙波)次數(shù)和持續(xù)時間、第1次刺探至首個E波出現(xiàn)之間的時間都明顯減少，但并未明顯改變韌皮部取食的時間，作者認(rèn)為在被感染的植株上，蚜蟲的口針在葉片組織內(nèi)移動的束縛力減弱，很可能是因為病毒的感染減弱了植物對蚜蟲的抗性能力。關(guān)于病原菌、寄主植物和媒介昆蟲三者之間的互作關(guān)系，尤其是病原菌對昆蟲取食方面的影響都不僅僅是單方面作用引起，會受到多種內(nèi)在與外在條件的影響(Cenetal., 2012； Wangetal., 2012; Palukaitisetal., 2013; Rajabaskaretal., 2014)，深入的機(jī)理有待進(jìn)一步研究驗證。未來互作關(guān)系的研究可以從木虱帶菌后基因表達(dá)水平入手，對取食有關(guān)的基因表達(dá)變化進(jìn)行深入研究，從而獲知木虱傳播黃龍病更深層的機(jī)理。

柑橘木虱具有獲菌速度快、傳病效率高的特點(Luoetal., 2015; Wuetal., 2016);而且據(jù)報道，寄主植物感染黃龍病后對柑橘木虱成蟲的吸引作用增強(qiáng)，而由于寄主染病增加了對木虱成蟲的取食障礙，導(dǎo)致成蟲轉(zhuǎn)移到健康的寄主(Cenetal., 2012; Wuetal., 2015)。本研究結(jié)果說明若蟲是最重要的獲菌階段，而且寄主感染黃龍病對若蟲的取食有利。黃龍病-柑橘-柑橘木虱的上述關(guān)系非常有利于黃龍病的傳播。因此，在生產(chǎn)上對柑橘木虱應(yīng)該采取零容忍的策略，通過隔離種植、栽培措施、保護(hù)天敵、冬季清園、噴藥保梢等途徑預(yù)防木虱的發(fā)生，橘園一旦發(fā)現(xiàn)木虱馬上噴藥補(bǔ)救，這對阻止黃龍病的傳播蔓延至關(guān)重要。