水稻條紋花葉病毒對介體電光葉蟬生長繁殖及取食行為的影響

李 盼, 張 潔, 岳 玥, 陳紅燕, 吳 維, 魏太云, 賈東升,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護學(xué)院, 福建省植物病毒學(xué)重點實驗室, 福州350002;2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所, 昆明 650000)

植物病毒是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要病原物，全球目前已報道的植物病毒約1 100種，其中約80%是由特定的介體昆蟲傳播，由于缺乏有效的防治方法，病毒病給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的損失(Ng and Falk 2006; Hogenhoutetal., 2008; 葉健等, 2018)。在農(nóng)作物病毒病害的流行發(fā)生中，介體昆蟲發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且植物病毒-介體昆蟲-寄主植物三者間形成了復(fù)雜的互作關(guān)系。首先，由于病毒與介體昆蟲的多樣性，植物病毒對介體昆蟲既存在有利的，也存在不利的影響(Hogenhoutetal., 2008; Whitfieldetal., 2015)。如感染水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)的水稻提高了其介體黑尾葉蟬Nephotettixcincticeps的存活率和產(chǎn)卵量，促進種群增長(王前進等, 2018)；而南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV)會顯著降低介體白背飛虱Sogatellafurcifera若蟲的存活率、延長若蟲的發(fā)育歷期及降低成蟲壽命和繁殖力(Tuetal., 2013)。其次，植物病毒可以通過影響介體昆蟲的取食行為而促進其自身的傳播 (Fereres and Moreno 2009; Dietzgenetal., 2016; Shikanoetal., 2017)，如植物病毒通過影響寄主植物的代謝過程或改變其性狀，直接或間接使介體昆蟲對寄主植物的吸引、選擇、定居和取食等行為發(fā)生變化，進而促進病毒在寄主植物間的傳播以及病害的遠(yuǎn)距離擴散(Moreno-Delafuenteetal., 2013; Luetal., 2016)。因此，植物病毒與介體昆蟲之間的互作關(guān)系成為影響田間病毒病流行的重要因素(Stoutetal., 2006)。

水稻條紋花葉病(rice stripe mosaic disease)是2015年在我國廣東省羅定市被首次發(fā)現(xiàn)的水稻新病害，感病水稻出現(xiàn)植株矮化、葉片條紋狀花葉、新葉扭曲，結(jié)穗率下降等癥狀(Yangetal., 2017a)。該病害由水稻條紋花葉病毒(rice stripe mosaic virus, RSMV)引起，RSMV屬于彈狀病毒科(Rhabdoviridae)細(xì)胞質(zhì)彈狀病毒屬Cytorhabdovirus的一個新種，主要由半翅目的電光葉蟬Reciliadorsalis以持久增殖型方式傳播(Yangetal., 2017b)，二點黑尾葉蟬Nephotettixvirescens是其次要傳播介體(Zhaoetal., 2019)。目前該病害已擴散到廣西、海南和云南等省，由于電光葉蟬種群繁殖能力強，擴散速度快，使該病害存在進一步蔓延的趨勢(Yangetal., 2018)。近年來的研究已明確RSMV的基因組特征，RSMV由介體電光葉蟬傳播的特性，以及RSMV在介體昆蟲體內(nèi)的侵染過程(Yangetal., 2017a, 2017b; Zhaoetal., 2019)，而關(guān)于RSMV如何影響電光葉蟬的生長繁殖和取食行為尚不清楚。

為此，本研究將通過生物學(xué)實驗測評RSMV對電光葉蟬生長發(fā)育的影響;利用EPG技術(shù)比較感染和未感染RSMV的電光葉蟬在水稻上的取食行為，探究RSMV對電光葉蟬取食行為的影響;采用Y型嗅覺儀研究電光葉蟬對感染和未感染RSMV的水稻的偏好性差異。從而明確電光葉蟬-寄主植物-病毒三者之間的相互關(guān)系，揭示RSMV擴散流行的機制，為建立有效的病毒病害防控技術(shù)體系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx和水稻

電光葉蟬采自廣東省羅定市，經(jīng)實驗室篩選繁殖后，無毒電光葉蟬在人工氣候室(溫度26±1℃，光周期16L∶8D，相對濕度60%～70%)中飼養(yǎng)于健康的感蟲水稻品種TN1上，用于電光葉蟬寄主選擇行為和生長發(fā)育實驗。

感染RSMV的水稻采自廣東省羅定市，種植于實驗室水稻病毒圃。電光葉蟬2齡若蟲在感染RSMV的水稻病株上取食2 d后轉(zhuǎn)移至TN1水稻幼苗上飼養(yǎng)，獲得電光葉蟬獲毒種群，獲毒后10 d的電光葉蟬用于EPG實驗。同時將獲毒后10 d的電光葉蟬向三葉期的日本晴水稻幼苗進行傳毒，傳毒后30 d通過癥狀觀察并參照Yang等(2017b)RT-PCR方法檢測水稻帶毒情況，鑒定后的帶毒水稻供試。同時以未進行傳毒的日本晴水稻作為健康水稻供試。

1.2 RSMV侵染后電光葉蟬生長和生命表參數(shù)的測定

為了明確RSMV對電光葉蟬生長的影響，取RSMV侵染的水稻病株放入飼毒籠中，接入孵化不足12 h的電光葉蟬若蟲約200頭取食12 h。同時用棉花包裹10 d苗齡的稻苗根部并裝入大試管中(長25 cm，直徑3 cm)，每試管1 株水稻，試管底部加適量水。接入毒株上取食12 h的若蟲1頭，以帶紗網(wǎng)的試管蓋封口。每日同一時間更換水稻幼苗1次，每12 h觀察和記錄若蟲的蛻皮情況，直至羽化為成蟲(Chenetal., 2016)，并計算出不同齡期的發(fā)育歷期。收集羽化后的成蟲，并參照Yang等(2017b)RT-PCR方法檢測電光葉蟬帶毒情況，篩選出100頭帶毒電光葉蟬。同時以在健康水稻上取食后的100頭若蟲作為對照組進行實驗。電光葉蟬飼養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為光周期16L∶8D、相對濕度60%～70%、溫度26±1℃。實驗重復(fù)3次。

為了明確RSMV對電光葉蟬種群繁殖的影響，按以上方法取400頭剛孵化的電光葉蟬若蟲至裝有1株10 d苗齡稻苗的大試管中單頭飼養(yǎng)，每日同一時間更換水稻幼苗1次。逐日觀察，并記錄1-5齡若蟲的存活數(shù)，以及羽化出的成蟲和雌蟲數(shù)。將羽化的成蟲雌雄配對放入一個裝有1株10 d苗齡稻苗的大試管中，每天更換稻苗，更換的水稻苗置于解剖鏡下解剖，記錄卵粒數(shù)，并將產(chǎn)的卵挑選到濾紙上孵化，統(tǒng)計孵化的卵數(shù)。在此過程中，若有雄蟲死亡，及時補充新的電光葉蟬雄蟲，直至雌蟲全部死亡。沒有產(chǎn)卵或所產(chǎn)卵均不能發(fā)育的雌蟲視為交配失敗。收集死后的成蟲并參照Yang等(2017b)RT-PCR方法檢測帶毒情況，篩選出帶毒電光葉蟬數(shù)據(jù)，計算存活率Su1-5、羽化率(Emr)、雌性率(Fr)、交配率(Cr)、繁殖力(Fy)和卵孵化率(Ehr)。根據(jù)種群起始數(shù)量(No)，預(yù)測下代種群數(shù)量(Nt)和種群趨勢指數(shù)(I)，計算公式為:Nt=No×Su1-5×Emr×Fr×Cr×Fy×Ehr;I=Nt/No。隨機取100頭健康的電光葉蟬1齡若蟲作為對照組進行實驗。實驗重復(fù)3次。

1.3 刺吸電位(EPG)記錄與分析

利用DC-EPG Giga-8(荷蘭瓦赫寧根大學(xué))刺吸電位技術(shù)監(jiān)測感染和未感染RSMV電光葉蟬口針在健康水稻上的取食行為差異。供試電光葉蟬成蟲饑餓處理2 h后，在CO2短暫麻醉條件下迅速將一段2～3 cm、直徑10 μm的金絲一端粘連在電光葉蟬的前胸背板上，另一端與EPG工作傳感器的銅線粘連，同時植物電極插在水稻生長的土壤中。當(dāng)電光葉蟬口針刺入水稻組織時，回路接通，電流信號經(jīng)電流放大器放大后保存于電腦上，再用Probe 3.4軟件轉(zhuǎn)化為波形圖譜輸出在電腦屏幕上保存、判斷并轉(zhuǎn)換為可供統(tǒng)計的數(shù)字文件(萬貴鈞， 2015)。每頭成蟲記錄5 h，每次記錄結(jié)束后更換昆蟲和水稻植株，感染RSMV和無毒電光葉蟬的處理組各測定15頭成蟲。實驗在25±1℃，相對濕度60%±10%的安靜房間內(nèi)進行。

電光葉蟬取食波形判定參照陳勇(2015)關(guān)于電光葉蟬取食波形的分析進行鑒定，EPG的各種波形代表刺吸式傳毒昆蟲的口針在寄主植物組織內(nèi)不同的刺探和取食行為，具有不同的生物學(xué)意義：NP波為非刺探波形，表示電光葉蟬停留在葉片上沒有刺探；A波代表試探性刺探，一般持續(xù)時間比較短；C波代表口針刺探到韌皮部之前的主動取食波；E波表示昆蟲口針在韌皮部內(nèi)的被動取食；F波表示昆蟲在刺探時的機械穿刺阻礙波；S波是刺探波之后的唾液分泌波；R波是休息波。波形分析采用Stylet軟件，記錄并輸出每一個波形從開始到結(jié)束的時間，并進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 電光葉蟬寄主選擇行為的生物測定

使用Y型嗅覺儀測定電光葉蟬成蟲對水稻的取食偏好性。取處于分蘗期的健康水稻和感染RSMV的水稻，分別放入2個味源瓶中，控制裝置流量為1.0 L/min。將30頭健康電光葉蟬成蟲引入Y型管的管柄中，待其爬至兩臂夾角處開始計時，觀察6 h內(nèi)電光葉蟬對兩臂味源瓶的選擇趨向(Wangetal., 2014)。6 h后停止行為觀察，記錄爬至各味源瓶中的電光葉蟬頭數(shù)。同時，取30頭飼毒后10 d的電光葉蟬成蟲引入Y型管的管柄中，按以上方法測試帶毒電光葉蟬對不同水稻的取食偏好性。6 h后統(tǒng)計爬至各味源瓶中的電光葉蟬數(shù)目，并收集蟲體，參照Yang等(2017b)RT-PCR方法檢測帶毒蟲數(shù)。每次測定更換Y型管，調(diào)換味源瓶方向，消除誤差，每次試驗重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)處理及分析。采用T檢驗比較分析電光葉蟬在健康與感病水稻上的發(fā)育歷期、成蟲壽命、羽化率及產(chǎn)卵量等。同時采用T檢驗比較分析電光葉蟬對健康與感病水稻的選擇偏好性以及RSMV對電光葉蟬成蟲取食波形出現(xiàn)次數(shù)和持續(xù)時間的影響。

2 結(jié)果

2.1 RSMV對電光葉蟬生長繁殖的影響

對不同齡期電光葉蟬若蟲在健康水稻幼苗上的發(fā)育歷期進行統(tǒng)計，獲得感染RSMV電光葉蟬若蟲和無毒電光葉蟬若蟲的1, 2, 3, 4和5齡若蟲期以及總?cè)粝x期(表1)。其中帶毒電光葉蟬1, 2, 3和5齡以及若蟲總發(fā)育歷期均較無毒電光葉蟬若蟲發(fā)育歷期顯著延長(P<0.05)，僅4齡若蟲發(fā)育歷期無顯著差異(P>0.05)(表1)。表明RSMV侵染電光葉蟬后顯著延長了電光葉蟬若蟲的發(fā)育歷期。

系統(tǒng)分析RSMV對電光葉蟬生命表的影響，發(fā)現(xiàn)帶毒電光葉蟬的若蟲存活率為65.75%，顯著低于無毒電光葉蟬的79.22%；帶毒電光葉蟬的羽化率為84.02%，顯著低于無毒電光葉蟬的90.56%(P<0.05)；帶毒電光葉蟬的繁殖力為58.38粒/雌蟲，顯著低于無毒電光葉蟬的85.44粒/雌蟲(P<0.05)；帶毒電光葉蟬的卵孵化率為60.28%，顯著低于無毒電光葉蟬的67.55%(P<0.05)；此外，帶毒電光葉蟬的雌性率和交配率與無毒電光葉蟬沒有顯著差異(P>0.05)。綜合計算帶毒電光葉蟬的F1代種群趨勢指數(shù)為8.45，顯著低于無毒電光葉蟬的19.48(P<0.05)(表2)。以上結(jié)果表明RSMV侵染電光葉蟬后顯著降低了昆蟲的若蟲存活率、羽化率、繁殖力和卵孵化率，從而顯著降低了F1代的種群趨勢指數(shù)，表明RSMV不利于電光葉蟬種群的繁衍。

表1 水稻條紋花葉病毒侵染對電光葉蟬若蟲發(fā)育歷期的影響Table 1 Effects of rice stripe mosaic virus (RSMV) infection on the nymphal duration of Recilia dorsalis

表2 水稻條紋花葉病毒侵染對電光葉蟬生命表參數(shù)的影響Table 2 Effects of rice stripe mosaic virus (RSMV) infection on the life table parameters of Recilia dorsalis

2.2 RSMV感染對電光葉蟬成蟲取食過程各波形出現(xiàn)次數(shù)和持續(xù)時間的影響

對帶毒和無毒電光葉蟬進行刺吸電位波產(chǎn)生次數(shù)和持續(xù)時間進行分析和統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)攜帶RSMV的電光葉蟬比無毒電光葉蟬取食過程中產(chǎn)生A, F, S和NP波的次數(shù)顯著增加(P<0.05)，產(chǎn)生C和E波的總次數(shù)沒有明顯差異(P>0.05)，而產(chǎn)生R波的次數(shù)顯著下降(P<0.05)(圖1: A)。同時對不同取食波形持續(xù)時間進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)攜帶RSMV的電光葉蟬產(chǎn)生A, C, F, S, R和NP波的時間顯著高于無毒電光葉蟬(P<0.05)，而產(chǎn)生的E波總時間顯著低于無毒電光葉蟬(P<0.05)(圖1: B)。綜合不同波形產(chǎn)生的次數(shù)和持續(xù)時間，以及波形所代表的取食行為，表明攜帶RSMV的電光葉蟬在水稻上刺探取食時增加了障礙波和刺探波的次數(shù)，以及唾液分泌波的次數(shù)和時間；同時電光葉蟬被動取食行為減少，休息波次數(shù)減少，但每次休息時間延長。

2.3 RSMV對電光葉蟬成蟲寄主選擇行為的影響

通過Y型嗅覺儀對電光葉蟬成蟲的寄主選擇行為進行測定，在無毒電光葉蟬成蟲中，約11頭選擇RSMV侵染的水稻，約5頭選擇健康水稻，表明無毒電光葉蟬成蟲極顯著趨向于選擇RSMV侵染的水稻(P<0.01)。同時在獲取RSMV的電光葉蟬成蟲中，經(jīng)檢測約8頭選擇健康水稻，約2頭選擇RSMV侵染的水稻，表明帶毒電光葉蟬極顯著趨向于選擇健康水稻(P<0.01)(圖2)。

圖1 水稻條紋花葉病毒對電光葉蟬成蟲取食波形出現(xiàn)次數(shù)(A)和持續(xù)時間(B)的影響Fig. 1 Effects of rice stripe mosaic virus (RSMV) infection on the number of waves (A) and duration (B) of each feeding waveform for Recilia dorsalis adultsA: 刺探波Probing wave; C: 主動取食波Active ingestion wave; E: 被動取食波Passive ingestion wave; F: 障礙波Obstructive wave; S: 唾液分泌波Saliva excreting wave; R: 休息波Resting wave; NP: 非刺探波Non-probing wave; Mock: 無毒電光葉蟬Nonviruliferous R. dorsalis; RSMV: 帶毒(RSMV侵染)電光葉蟬Viruliferous (RSMV-infected) R. dorsalis. 圖中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；星號表示電光葉蟬在健康水稻和RSMV侵染水稻上產(chǎn)生不同取食波形出現(xiàn)次數(shù)或持續(xù)時間差異顯著(P<0.05, T檢驗)。Data in the figure are mean±SE. The asterisk indicates significant difference in the number of waves and duration of each feeding waveform between R. dorsalis adults feeding on healthy and RSMV-infected rice plants (P<0.05, T-test).

圖2 攜帶 RSMV和無毒電光葉蟬成蟲對健康和感病水稻的選擇Fig. 2 Host plant selection of RSMV-infected and non-infected Recilia dorsalis adults to healthy and RSMV-infected rice plants圖中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；雙星號表示電光葉蟬成蟲在健康水稻和RSMV侵染水稻間選擇性取食的差異極顯著(P<0.01, T檢驗)。Data in the figure are mean±SE. The double asterisk indicates extremely significant difference in the selection of R. dorsalis adults to healthy and RSMV-infected rice plants (P<0.01, T-test).

3 討論

植物病毒的傳播是基于病毒-宿主-介體間三者互作關(guān)系的復(fù)雜過程(Dáderetal., 2017)。植物病毒對介體昆蟲的影響直接關(guān)系到病害的擴散和蔓延(Maucketal., 2012)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)RSMV侵染延長了電光葉蟬若蟲的總發(fā)育歷期?；陔姽馊~蟬若蟲的獲毒和傳毒效率均高于成蟲(Yangetal., 2017b)，推測病毒侵染延長若蟲的發(fā)育歷期對病毒的傳播是有利的。同時發(fā)現(xiàn)RSMV對電光葉蟬的存活率、羽化率和繁殖力有顯著影響，與無毒電光葉蟬相比，RSMV侵染的電光葉蟬存活率下降，羽化率降低，產(chǎn)卵率顯著下降，導(dǎo)致種群趨勢指數(shù)顯著下降。這與水稻瘤矮病毒(rice gall dwarf virus, RGDV)對電光葉蟬生長繁殖的影響(Chenetal., 2016)相似，而不同于RDV有利于黑尾葉蟬種群的繁殖(王前進等, 2018)。表明電光葉蟬作為主要介體傳播RSMV和RGDV的過程中，病毒的侵染降低了電光葉蟬的生長繁殖能力而不利于其種群的增長。

以持久增殖型方式傳播的植物病毒需在昆蟲體內(nèi)增殖并擴散到唾液腺，隨著唾液的分泌傳播到健康植物(Hogenhoutetal., 2008)。植物病毒在昆蟲體內(nèi)的增殖對介體昆蟲的取食行為產(chǎn)生直接的影響。本研究通過EPG測定發(fā)現(xiàn)RSMV感染的電光葉蟬在健康水稻上刺探取食的刺探波和取食時唾液分泌波次數(shù)顯著增多，同時在水稻上刺探取食產(chǎn)生的障礙波次數(shù)和時間也增多，表明病毒侵染降低了電光葉蟬在植物韌皮部成功取食的能力，需要更多的刺探嘗試。這些因素的變化有利于介體電光葉蟬在刺探過程中將攜帶病毒的唾液分泌到植物中，從而提高病毒的傳播效率(施艷等, 2013)。該現(xiàn)象與RGDV對電光葉蟬取食行為的影響(陳勇, 2015)相同，推測一方面病毒侵染的電光葉蟬可能需要獲取更多的能量物質(zhì)維持除自身需要外病毒增殖的需求，另一方面病毒侵染降低了電光葉蟬成功取食的能力，產(chǎn)生更多的障礙波，這也可能是病毒侵染導(dǎo)致電光葉蟬種群繁殖能力下降的重要原因。此外，在帶毒蟲主動取食波時間延長的情況下，被動取食行為減少，休息波次數(shù)減少，進一步表明RSMV侵染不利于電光葉蟬的取食，導(dǎo)致其增加主動取食行為，并減少了休息頻率。

然而，植物病毒也可以通過間接作用改變介體昆蟲的寄主選擇傾向性，以利于病毒的傳播和擴散(施艷等, 2013)。本研究發(fā)現(xiàn)感染RSMV的水稻顯著吸引電光葉蟬前來取食，而帶毒電光葉蟬傾向于取食健康水稻，表明RSMV對電光葉蟬寄主選擇傾向性的影響，有利于病毒在植物間的擴散。該結(jié)果與SRBSDV對介體白背飛虱寄主選擇傾向性的影響，黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)對介體蚜蟲寄主選擇傾向性的影響(Maucketal., 2010; Wangetal., 2014)相似，均表現(xiàn)出感病植株對無毒介體昆蟲的吸引，以及帶毒介體昆蟲對健康植株的喜好。表明這種病毒對介體昆蟲寄主選擇傾向性的影響模式一方面提高了介體昆蟲種群的獲毒率，另一方面促進了帶毒種群對病毒的傳播效率，同時也表明持久傳播和非持久傳播的植物病毒與介體昆蟲間存在相似的互作模式。已有的研究表明CMV通過沉默抑制子2b蛋白與擬南芥Arabidopsisthaliana和煙草茉莉酸防御途徑下游的JAZ蛋白互作而抑制茉莉酸的生成，從而提高感病植株對介體蚜蟲的吸引力 (Wuetal., 2017)，而關(guān)于RSMV如何調(diào)控植物激素或揮發(fā)物影響昆蟲寄主選擇傾向性的機制尚不清楚，后續(xù)將進一步深入研究。