黃芪、苦參、皂角刺抗肝癌作用的比較研究

張喬，李靜，張琦，崔聞宇，王赫，李廷利

(1.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

肝癌為“以氣血虧虛為本，邪毒內侵集聚于肝”所致?！峨y經(jīng)》中記載：“肝之積名曰肥氣，在左脅下，如覆杯?！迸R床可見患者右胸下有痛感，體型明顯消瘦甚至枯瘦[1-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學對肝癌的經(jīng)典治療方法常伴有臨床治療指征的限定[4-5]，以及姑息治療中帶來的毒副作用對機體整體免疫功能的影響[6-7]。中藥對肝癌的治療主要在于扶正益氣、疏肝健脾，對于癌癥中晚期患者也可改善其身體狀態(tài)，包括提高其生活質量,延長生命周期[8-10]。近年來采用中醫(yī)藥治療肝癌備受關注[11]，本課題在查閱大量中藥抗肝癌文獻基礎上，以及中醫(yī)中藥臨床應用有效性的探索中，擬進行傳統(tǒng)中藥黃芪、苦參和皂角刺的體內和體外抗肝癌作用比較研究，以期探究中藥抗肝癌的藥效學作用，為臨床中醫(yī)中藥開展個體化治療和中藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及細胞

KM小鼠：清潔級，體質量18～20 g，雄性，購自哈爾濱醫(yī)大二院實驗動物中心，批號為20171025。H22肝癌瘤株、HepG2肝癌細胞均由抗腫瘤天然藥物教育部工程研究中心(哈爾濱商業(yè)大學藥學院所轄)提供。

1.2 實驗藥物

黃芪藥材由哈爾濱商業(yè)大學藥學院中藥教研室鑒定為豆科植物膜莢黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.]的干燥根。于三棵樹藥材市場皖北藥房購買。

苦參藥材由哈爾濱商業(yè)大學藥學院中藥教研室鑒定為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根。于三棵樹藥材市場皖北藥房購買。

皂角刺藥材由哈爾濱商業(yè)大學藥學院中藥教研室鑒定為豆科植物皂莢(GleditsiasinensisLam.)的干燥棘刺。于三棵樹藥材市場皖北藥房購買。

1.3 主要實驗試劑

順鉑注射液(批號:180704，江蘇豪森藥業(yè))；RPMI-1640[批號:AD17321268，美國HyClone(上海)代理公司]；青鏈霉素混合液[批號:20180607，美國Solarbio(北京)經(jīng)銷公司]；胰蛋白酶(批號:20180122，北京Biotopped公司)；小牛血清(批號:18060505，杭州四季青生化試劑公司)

1.4 儀器

KD-TS6A組織脫水機(金華KEDEE生化儀器公司)；KD-BM生物組織包埋機(金華KEDEE生化儀器公司)；KD-202石蠟切片機(金華KEDEE生化儀器公司)；KD-TH生物組織攤烤片機(金華KEDEE生化儀器公司)；CX41顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)[日本OLYMPUS(深圳)代理廠]；Infinite F50酶標儀[瑞士TECAN(上海)貿易公司]。

2 實驗方法

首先在小鼠體內構建H22肝癌細胞皮下移植瘤模型并進行評價；其次探究由黃芪、苦參、皂角刺單味藥對H22肝癌細胞荷瘤小鼠的藥效學作用比較；最后進行體外實驗探究上述單味藥有效成分的抗肝癌作用比較研究。

2.1 H22肝癌荷瘤小鼠模型建立和觀察指標

2.1.1 H22肝癌荷瘤小鼠模型的建立

將H22瘤源置于標準實驗室傳代培養(yǎng)后，腹腔接種，制作小鼠腹水模型。將KM小鼠50只隨機分成5組(模型組1～模型組5)，每組10只，抽取腹部飽滿瘤源小鼠腹水，接種于KM小鼠右前肢腋下[12-14]，每只0.2 mL。

2.1.2 移植瘤體積指數(shù)

觀察記錄荷瘤小鼠皮下移植瘤形成狀況，用帶表卡尺隔日測量長徑與橫徑，按如下公式計算移植瘤體積并繪制折線圖。

V=(ab)2/2

a為長徑，b橫徑

2.1.3 HE染色

切取約0.8 mm3體積腫瘤組織切片，經(jīng)反復染色、洗滌后，過缸脫水、封片、烘干。病理圖象分析系統(tǒng)照相，觀察病理改變。

2.2 對H22荷瘤小鼠體內抗肝癌作用的比較實驗

2.2.1 藥液的制備

分別稱取黃芪、苦參和皂角刺，經(jīng)乙醇回流提取，濃縮得浸膏，加水調整濃度，分別制得黃芪、苦參、皂角刺濃縮液均為0.12 g/mL。

2.2.2 給藥方案

建立肝癌細胞小鼠移植模型1 d后，連續(xù)給藥21 d。3味中藥分別按2 400、1 200、600 mg/kg進行高、中、低劑量組灌胃給藥；空白組、模型組給予同等劑量生理鹽水，每日1次；陽性藥組按4 mg/kg腹腔注射順鉑注射液，每5日1次。

2.2.3 對基本體征的影響

逐日觀察并記錄動物以下基本情況：1)攝食飲水；2)體毛、精神狀態(tài)；3)排泄物與分泌物；4)行為表現(xiàn)；5)體表、肌膚完整度；6)死亡情況。

2.2.4 對體質量的影響

每5日上午8:30在給藥前，進行實驗動物稱重。

2.2.5 對移植瘤生長的影響

于每日固定時間觀察荷瘤小鼠皮下移植瘤形成狀況，用帶表卡尺隔日測量長徑與橫徑，按公式V=(ab)2/2(a為長徑，b橫徑)計算移植瘤體積并繪制折線圖。

2.2.6 對免疫器官重量及免疫器官重量指數(shù)的影響

連續(xù)給藥21 d后停藥，隔日取材。處死小鼠后快速剝取胸腺及脾臟，稱濕重，記錄并計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)=(免疫器官鮮重/動物體質量)×100%

2.2.7 對主要臟器重量及主要臟器重量指數(shù)的影響

取材日處死小鼠后快速剝取心、肝、雙腎，稱濕重，記錄并計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=(臟器鮮重/動物體質量)×100%

2.2.8 對瘤重及抑瘤率的影響

取材日處死小鼠后，快速鈍性剝離瘤組織，觀察，稱重，記錄并計算抑瘤率。

抑瘤率=(1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%

2.3 各單味藥有效成分體外抗肝癌作用的比較實驗

分別配制黃芪多糖、苦參堿、槲皮素各5個梯度濃度即1 mg/mL、0.5 mg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL作為受試濃度，進行MTT實驗。

用酶標儀在490 nm下測吸光度。計算細胞增殖抑制率和IC50。

3 實驗結果

3.1 H22肝癌荷瘤小鼠模型評價

3.1.1 移植瘤生長情況

皮下接種H22細胞腹水后第5天，于小鼠接種部位以指腹可觸及較硬凸起小塊即為皮下移植瘤。隔日測量荷瘤小鼠皮下移植瘤體積結果見表1。隔日測量各組皮下瘤塊體積相近，無顯著差異，接種分組后第21天腫瘤體積均在1 000 mm3以上。

組別5 d7 d9 d11 d13 d15 d17 d19 d21 d模型1組61.12±2.78135.61±5.44246.05±10.22390.09±10.63588.81±34.651 106.05±101.221 315.99±109.571 590.09±125.631 748.81±180.65模型2組60.82±1.74137.23±8.64243.37±13.37389.87±12.94584.46±22.991 043.37±63.371 315.67±83.221 588.87±92.941 684.46±302.99模型3組60.06±2.71130.58±6.67239.66±9.05385.60±13.66581.63±14.171 039.66±39.051 309.47±79.861 585.60±103.661 691.63±261.17模型4組60.59±3.01132.41±4.78242.72±9.63384.47±13.94579.20±41.65982.72±119.631 288.09±121.761 484.47±193.941 679.20±232.65模型5組59.83±1.97135.05±3.73240.08±6.65386.15±12.67575.61±16.481 040.08±86.651 312.15±87.281 581.15±82.671 775.61±168.48

荷瘤小鼠瘤體生長曲線見圖1，表明各曲線重合度良好，各組移植瘤生長趨勢無明顯差異?？梢姶嗽炷し椒尚校Ｐ蛷椭坡矢?。

圖1 荷瘤小鼠皮下移植瘤均數(shù)生長曲線

3.1.2 HE染色

皮下移植瘤組織的病理改變見圖2。低倍鏡下樣本均可見部分粉色成片壞死細胞碎片，約占20%～45%；高倍鏡下細胞多呈卵圓形；核深染，細胞質較少，核質比例失常。組間細胞形態(tài)均無明顯差異?？梢?，此造膜方法可行，模型復制率高。

3.2 對H22荷瘤小鼠體內抗肝癌作用的比較實驗結果

3.2.1 對荷瘤小鼠基本體征的影響

陽性藥組：小鼠平均攝食差，體型較小，脂肪明顯少，皮膚松弛，活動度低，多體形消瘦，精神狀態(tài)欠佳。

模型組：小鼠攝食狀況一般，瘤體積較大，右前肢行動不便，接種部位外表皮多出現(xiàn)傷口。

黃芪組：與陽性藥組相比，小鼠攝食狀況良好；與模型組相比，傷口愈合狀況良好。

苦參和皂角刺組：與模型組相比，小鼠瘤體積較小。

3.2.2 對體質量的影響

實驗各組小鼠體質量變化結果見表2。接種分組后第1天，各組體質量較均衡，無顯著差異。第11天，與模型組相比，陽性藥組體質量降低(P<0.05)。第15天，與空白組相比，模型組體質量減少量超過10%。第15天以后，與陽性藥組相比，各組體質量均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，黃芪高劑量組體質量較大(P<0.05)。

注：A：模型1組(100×)；B：模型1組(400×)；C：模型2組(100×)；D：模型2組(400×)；E：模型3組(100×)；F：模型3組(400×)；G：模型4組(100×)；H：模型4組(400×)；I：模型5組(100×);J:模型5組(400×)圖2 各組移植瘤組織病理情況觀察結果(HE)

3.2.3 對移植瘤生長的影響

荷瘤小鼠瘤體體積生長狀況見表3。接種后第5天～第21天9次測量結果表明，與模型組相比，陽性藥組皮下移植瘤體積顯著減小(P<0.01)；第17天～第21天，與模型組相比，苦參、皂刺高劑量組皮下移植瘤體積顯著減小(P<0.01)。瘤體生長曲線見圖3。模型組與其他中藥低劑量組瘤體積生長曲線較為陡峭且融合，只有陽性藥組的生長曲線與其他組完全分離，且趨勢更為平緩。

圖3 荷瘤小鼠皮下移植瘤均數(shù)生長曲線

組別1 d5 d11 d15 d21 d空白組18.82±2.1124.36±2.1429.84±1.64**##33.33±1.16**##40.15±2.20**##模型組18.24±1.4823.55±1.3326.89±1.4729.53±2.25##36.06±2.95##陽性藥組19.46±1.3223.66±1.1024.09±2.35*26.05±2.34**28.30±2.06**黃芪高劑量組18.72±1.9424.92±2.3227.25±2.00##31.78±1.93*##38.13±1.75*##黃芪中劑量組19.43±1.7324.30±1.9327.42±2.04##30.05±2.10##36.55±2.34##黃芪低劑量組18.90±2.2523.94±2.3425.67±2.1029.40±2.48##36.34±2.86##苦參高劑量組18.88±1.5623.54±1.8827.60±2.32##30.98±2.60##37.01±3.55##苦參中劑量組19.65±1.8224.67±1.8026.31±2.0829.55±3.75##36.48±2.97##苦參低劑量組19.25±2.0623.72±2.4925.99±3.4829.78±2.98##35.98±2.51##皂刺高劑量組19.33±1.6724.73±1.7226.86±1.30##29.97±3.60##36.75±3.93##皂刺中劑量組19.20±1.5624.34±1.3126.60±1.7229.44±2.18##35.64±2.60##皂刺低劑量組19.42±1.7824.25±2.6426.32±2.7228.99±3.19##36.20±3.28##

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與陽性藥組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別5 d7 d9 d11 d13 d15 d17 d19 d21 d模型組63.21±7.78 140.15±13.64 255.48±13.89 395.38±12.51 596.54±44.21 1 076.71±119.15 1 334.09±179.63 1 620.0±164.43 1 898.81±156.37陽性藥組37.79±5.41△76.94±5.64△131.59±4.73△190.18±5.44△257.86±10.64△319.73±12.22△395.38±13.39△472.35±33.89△557.35±41.71△黃芪高劑量組65.57±8.97130.99±16.91239.90±8.05381.71±26.37552.68±21.72986.89±37.551 239.88±75.681 516.67±108.091 731.63±201.79黃芪中劑量組67.78±5.80134.48±7.74236.27±12.88388.87±12.94588.34±10.501 121.35±103.841 378.74±158.981 578.32±136.671 809.55±245.37黃芪低劑量組66.59±10.01134.63±14.90260.74±11.85410.89±23.78605.20±41.651 082.72±123.601 318.54±343.431 684.99±146.831 909.39±225.33苦參高劑量組55.83±11.86125.07±13.55230.08±16.67351.15±22.88523.98±34.28979.45±56.551 148.53±127.28*1 321.15±282.67*1 445.95±268.83**苦參中劑量組60.87±11.94132.32±8.56249.74±10.37368.37±10.94564.36±26.341 003.74±66.861 215.67±113.551 568.45±152.231 704.66±162.67苦參低劑量組60.59±5.56132.14±7.48244.72±10.56384.47±13.94529.20±41.651 082.72±119.631 388.09±121.761 584.47±183.951 709.80±215.65皂刺高劑量組58.28±8.47138.60±5.99233.37±13.37369.70±17.58528.46±17.601 003.66±44.981 199.34±65.50*1 380.50±75.63*1 484.86±102.55**皂刺中劑量組65.86±6.67138.47±10.05245.80±23.56389.63±28.34562.59±35.66977.45±120.781 280.54±261.541 487.63±234.551 725.43±306.89皂刺低劑量組67.73±16.67144.32±18.34267.22±17.89378.67±28.65588.64±52.861 143.37±63.371 315.98±83.221 601.67±156.451 840.20±276.21

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01

3.2.4 對免疫器官重量及免疫器官指數(shù)的影響

免疫器官濕重及免疫器官指數(shù)結果見表4。與模型組相比，陽性藥組胸腺重量減小(P<0.05)，黃芪高劑量組顯著增大(P<0.01)；與模型組相比，陽性藥組胸腺重量顯著降低(P<0.01)黃芪高劑量組顯著升高(P<0.01)?？瞻捉M脾臟重量明顯高于其他組，陽性藥組顯著低于模型組，但考慮自身體質量影響忽略；除空白組與其他組有明顯差異外，并無其他組間差異。

3.2.5 主要器官的臟器指數(shù)比較

主要器官臟器指數(shù)結果見表5?？瞻捉M與陽性藥組肝臟指數(shù)最低且顯著低于其他各組(P<0.01)；中藥給藥組中苦參高劑量組、皂刺高劑量組顯著低于模型組(P<0.05),心臟、肺臟、雙腎的臟器指數(shù)組間無統(tǒng)計學差異并且無明顯規(guī)律。

3.2.6 對瘤重與抑瘤率的影響

瘤體濕重與抑制瘤率結果見表6。陽性藥組平均瘤重最低且明顯低于其他組；與模型組相比苦參和皂刺高、中劑量組平均瘤重顯著降低(P<0.01)。觀察抑制率數(shù)據(jù)結果，陽性藥組腫瘤抑制率最高，為89.39%；中藥給藥組中腫瘤抑制率高于40%的有兩組，為苦參高劑量組和皂刺高劑量組，兩組腫瘤抑制率分別為51.89%、46.21%；黃芪低劑量組腫瘤抑制率最低，且與苦參、黃芪各劑量組的數(shù)據(jù)綜合比較，黃芪各劑量組腫瘤抑制率低。

組別胸腺重脾臟重胸腺指數(shù)脾臟指數(shù)空白組0.18±0.06**##0.43±0.10*0.46±0.10**##1.09±0.34模型組0.08±0.030.30±0.050.23±0.05##0.74±0.22陽性藥組0.05±0.02*0.17±0.07**0.18±0.04**0.67±0.20黃芪高劑量組0.13±0.04**##0.31±0.120.34±0.07**##0.79±0.31黃芪中劑量組0.10±0.02##0.28±0.080.27±0.04##0.74±0.26黃芪低劑量組0.09±0.02##0.26±0.100.25±0.03##0.72±0.24苦參高劑量組0.10±0.03##0.27±0.130.28±0.06##0.73±0.33苦參中劑量組0.09±0.02##0.27±0.110.25±0.05##0.74±0.28苦參低劑量組0.08±0.01##0.25±0.070.22±0.03##0.69±0.18皂刺高劑量組0.09±0.03##0.26±0.060.25±0.06##0.71±0.17皂刺中劑量組0.08±0.01##0.25±0.070.22±0.03##0.70±0.18皂刺低劑量組0.08±0.02##0.27±0.080.22±0.06##0.72±0.23

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與陽性藥組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別肝臟指數(shù)心臟指數(shù)肺臟指數(shù)雙腎指數(shù)空白組4.18±0.96**0.47±0.150.48±0.121.27±0.28模型組5.68±0.890.50±0.100.53±0.151.27±0.25陽性藥組4.05±1.25*0.48±0.160.48±0.121.05±0.36黃芪高劑量組5.63±1.28##0.51±0.140.54±0.151.39±0.31黃芪中劑量組5.50±1.02##0.50±0.080.57±0.141.36±0.26黃芪低劑量組5.79±0.62##0.52±0.120.55±0.131.30±0.24苦參高劑量組4.98±0.68*##0.51±0.100.48±0.161.33±0.28苦參中劑量組5.27±1.04##0.45±0.110.47±0.131.23±0.33苦參低劑量組5.60±1.07##0.47±0.120.52±0.171.29±0.18皂刺高劑量組5.19±0.83*##0.45±0.110.48±0.141.37±0.23皂刺中劑量組5.46±0.71##0.49±0.130.52±0.131.25±0.18皂刺低劑量組5.53±1.42##0.47±0.150.48±0.171.22±0.17

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與陽性藥組比較，#P<0.05，##P<0.01

表6 各組瘤體濕重(g)與抑瘤率情況比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 各單味藥有效成分體外抗肝癌作用的比較

3.3.1 黃芪多糖對HepG2細胞增殖的影響

黃芪多糖各濃度組OD值與抑制率結果見表7。與空白組相比，順鉑組、黃芪多糖1 mg/mL、0.5 mg/mL、250 μg/mL組OD值均顯著降低(P<0.01)。按照改良寇式法計算黃芪多糖IC50為486.56 μg/mL。

表7 黃芪多糖對HepG2細胞增殖的影響

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01

3.3.2 苦參堿對HepG2細胞增殖的影響

苦參堿各濃度組OD值與抑制率結果見表8。與空白組相比，順鉑組、苦參堿1 000 g/mL、500 mg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL組OD值顯著降低(P<0.01)。按照改良寇式法計算苦參堿IC50為326.31 μg/mL。

表8 苦參堿對HepG2細胞增殖的影響

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01

3.3.3 槲皮素對HepG2細胞增殖的影響

苦參堿各濃度組OD值與抑制率結果見表9。與空白組相比，順鉑組、槲皮素200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.25 μg/mL組OD值顯著降低(P<0.01)。按照改良寇式法計算槲皮素IC50為69.72 μg/mL。

表9 槲皮素對HepG2細胞增殖的影響

注：與空白組比較，※P<0.05，※※P<0.01

4 討論

目前西藥抗腫瘤藥的研制取得突破性進展，具有作用靶點明確、療效可靠的優(yōu)勢，但同時產(chǎn)生的毒副作用等劣勢日漸明顯，造成臨床腫瘤患者的死因往往不是因為癌癥擴散和轉移，而是由于化療藥物的毒副作用引起[15]。基于此，中藥在治療腫瘤患者發(fā)揮增效減毒的治療優(yōu)勢突顯[16-18]。上述實驗結果表明，黃芪、苦參和皂角刺均可提高機體基本指征、免疫器官指數(shù)等，由此提示三者均可提高小鼠的免疫功能，其中尤以黃芪在提高荷瘤小鼠的免疫功能方面具有突出表現(xiàn)；另外，三者均具有抗肝癌細胞和抑制腫瘤生長的藥理作用，但黃芪抗肝癌的藥效學作用不及與苦參、皂角刺顯著。

苦參和皂角刺在中醫(yī)學中都可作為外用藥用來治療外科瘡瘍腫毒，均具有清熱解毒、殺蟲、托毒外出的作用。這與現(xiàn)代藥理學研究表明二者具有抗腫瘤活性不謀而合。而黃芪作為傳統(tǒng)中藥的補氣藥材，具有益氣固表、消毒斂瘡的功效。因此，在抗腫瘤的同時，現(xiàn)代藥理學研究表明黃芪還可以通過改善荷瘤小鼠的胸腺狀況，提高小鼠自身免疫力，同時緩解食欲低下，并改善體質量降低的肝癌惡病質情形。因此，黃芪、苦參和皂角刺在具有抗肝癌藥效的同時，還具有提高免疫的功能。通過本課題研究表明，黃芪抗肝癌的作用稍遜于苦參和皂角刺，但可明顯改善機體綜合免疫器官指數(shù)和基本生命體征，從而提示其具有提高免疫功能的作用。