基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅花治療非酒精性脂肪肝的可能性*

鄧 楠，樊姝寧，徐 甜，程發(fā)峰，王雪茜，王慶國

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是指以除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與肥胖、高血糖、高脂血癥關(guān)系密切，是造成慢性肝病、肝功能異常的主要原因之一[1]。目前全球流行病學(xué)調(diào)查表明，NAFLD在全球的發(fā)病率為10%～30%，亞洲國家平均為11%～16%，中國的患病率約15%，且逐步呈低齡化趨勢[2-3]。盡管近年來NAFLD的發(fā)病率持續(xù)增加，但臨床上仍缺乏公認的對NAFLD具有明顯療效的藥物治療。目前的主要治療方法是以調(diào)節(jié)血脂作為輔助治療，同時改變生活方式、健康飲食和規(guī)律運動，從而促進脂肪減少以減緩NAFLD病程進展，然而效果并不理想[4]。

中醫(yī)藥治療NAFLD結(jié)合辨證與辨病的特點，治療方法多樣，在一定程度上可以有效阻止病情的發(fā)展。紅花為菊科植物紅花的干燥花，性溫，味辛，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)，祛瘀止痛的功效。實驗研究表明紅花注射液的使用提高了高脂血癥的治療有效率，縮短了治療時間[5]。同時，紅花提取物可以降低血漿黏度，減少氧自由基，降低脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞損傷程度從而提高其抗氧化能力[6]。表明紅花具有降血脂、減輕氧化應(yīng)激的作用。因此，筆者推論紅花可以治療NAFLD。研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選出紅花的活性成分，挖掘出其治療NAFLD的多靶點與多通路，為闡明紅花治療NAFLD提供參考。

1 方法

1.1 紅花所含化學(xué)成分的收集與篩選 本研究采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“紅花”為關(guān)鍵詞，檢索紅花的化學(xué)成分共計189個。生物利用度是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）特性中最重要的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)之一?？诜侵兴幵谖改c道發(fā)揮作用的最主要途徑，因此本研究主要以紅花中化合物口服生物利用度篩選閾值均≥30%，化合物類藥性篩選閾值均≥0.18，以此得到符合條件的候選化合物。

1.2 紅花靶點預(yù)測 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫結(jié)果，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www．uniprot．org/）獲得與化合物相對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，利用Swiss靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫（http：//swisstargetprediction.ch/）找到該化合物的預(yù)測靶點。

1.3 挖掘已知的NAFLD相關(guān)靶點 從目前可用的DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http：//www.disgenet.org/2019版v6.0）和 OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：//omim.org/）中，以“非酒精性脂肪肝”為關(guān)鍵詞，獲取NAFLD的已知靶點。

1.4 GO與通路富集分析 GO分析包括：生物過程（BP）、細胞組分（CC）和分子功能（MF）。KEGG通路富集分析是描述候選靶點特征的常用方法，本研究以P＜0.05作為假定值，利用數(shù)據(jù)庫對GO和KEGG信號通路分析。

1.5 成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將紅花的有效活性成分與其治療NAFLD的潛在作用靶標關(guān)系及以P＜0.05的KEGG通路中前10位信號通路導(dǎo)入Cytoscape軟件中，構(gòu)建出成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 紅花的活性化合物 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲取紅花中OB≥30%，DL≥0.18的化合物共18個。見表1。

表1 紅花的主要活性成分Tab.1 Main active components of Carthamus tinctorius

2.2 紅花與NAFLD交集靶點 根據(jù)篩選出的紅花預(yù)測靶點及已知NAFLD靶點，利用omicshare軟件畫出維恩圖，分析出交集靶點38個。見圖1。

2.3 蛋白交互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING軟件構(gòu)建了紅花治療NAFLD交互靶點間的蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)包含38個蛋白質(zhì)節(jié)點，140條相互作用關(guān)系（連線）。見圖2。

圖1 紅花和NAFLD交互的38個常見靶點Fig.1 The 38 common targets for interaction between Carthamus tinctorius and nonalcoholic fatty liver disease

圖2 基于STRING的藥物-疾病靶標相互作用圖Fig.2 Drug-disease target interaction map based on STRING treatment of nonalcoholic fatty liver disease

2.4 GO富集結(jié)果分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫，將交互靶點的GO生物過程富集分析結(jié)果按照P由低到高排序，選擇排名前10的數(shù)據(jù)結(jié)果，得到生物過程結(jié)果如圖3A所示：分別為RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、調(diào)控細胞增殖、蛋白質(zhì)磷酸化、膽固醇儲存負調(diào)控、細胞內(nèi)受體信號通路。細胞成分的分析結(jié)果如圖3B所示，靶點主要涉及核、細胞質(zhì)、質(zhì)膜、受體和胞漿等。分子功能如圖3C所示，靶點主要涉及類固醇激素受體活性、藥物結(jié)合、酶結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、鐵離子結(jié)合、受體結(jié)合等。

圖3 對交互的基因進行GO分析Fig.3 GO analysis of interacting genes

2.5 紅花成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò) 該網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點61個，邊134條。不同節(jié)點有不同的意義，其中菱形節(jié)點代表活性成分，正方形節(jié)點代表作用交集靶標，圓形代表信號通路，而邊則代表成分、靶標及信號通路的關(guān)系。不同靶標可對應(yīng)相同的活性成分及信號通路，同一靶標也可與不同的活性成分及信號通路相對應(yīng)，可見紅花治療NAFLD具有多成分、多靶點、多信號通路的特點。見圖4。

2.6 KEGG通路富集分析 將基因名稱導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建KEGG通路富集分析，以P＜0.05判斷具有顯著性進行篩選，共獲得33條富集通路，其中前10條KEGG通路分別為胰島素抵抗、PPAR信號通路、脂肪細胞因子信號通路、泌乳素信號通路、丙型肝炎、NAFLD、甲型流感、弓形蟲病、血清素的神經(jīng)突觸、AMPK信號通路。見圖5。表明紅花的有效成分可能通過作用以上通路來治療NAFLD。根據(jù)以上分析，基于P值，選擇胰島素抵抗通路進一步了解紅花治療NAFLD的可能性。概念圖包含了胰島素抵抗通路中紅花的靶點和NAFLD靶點，基于這些數(shù)據(jù)，假設(shè)紅花通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗通路治療NAFLD。概念圖見圖6。

圖4 紅花成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Carthamus tinctorius constituents-target-signal pathway network

圖5 活性靶點KEGG代謝通路氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of active target KEGG metabolic pathway

3 討論

中醫(yī)藥治療NAFLD的優(yōu)勢已逐漸顯現(xiàn)，單味藥或諸藥合用都能調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，促進吸收和排泄，且可避免長期服用西藥帶來的不良反應(yīng)。紅花具有明顯的降脂、抗氧化的作用，且能有效治療高脂血癥。

研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共發(fā)現(xiàn)紅花化學(xué)成分189個，進一步篩選獲得主要活性成分18個，為紅花的研究提供了更多可能性。

圖6 紅花在胰島素抵抗通路中的KEGG富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of Carthamus tinctorius in insulin resistance pathway

通過構(gòu)建靶點維恩圖，共獲得紅花治療酒精性脂肪肝相關(guān)靶點38個。分析交集靶點KEGG通路富集得到P＜0.05通路共33條，其中胰島素抵抗通路P值最小，富集靶點最多，分別為Akt，PPARA，TNF-α，GSK3B，PTP1B，INSR，CPT1A，LXR-α，提示紅花最有可能通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗通路治療NAFLD。其中，Akt磷酸化減少，可以降低下游葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）表達，抑制葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運，增加胰島素抵抗[7]。PPARA能有效誘導(dǎo)脂肪酸攝取、細胞內(nèi)脂肪酸活化與結(jié)合、脂肪酸延伸和去飽和、三酰甘油（TG）和脂滴的形成與分解等多種脂質(zhì)代謝途徑的基因表達[8]。TNF-α是胰島素抵抗調(diào)節(jié)過程中的重要因子，加快脂肪細胞分解，釋放大量游離脂肪酸（FFA）的同時抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累，從而誘發(fā)NAFLD。TNF-α促進釋放的FFA可以介導(dǎo)胰島素抵抗，反之胰島素抵抗與NAFLD的發(fā)生發(fā)展會導(dǎo)致FFA的升高，而FFA又可促使TNF-α升高，從而加重胰島素抵抗和NAFLD[9]。GSK3B是P13K/AKT通路的一個主要基質(zhì)，胰島素刺激的AKT磷酸化GSK3B絲氨酸，從而使GSK3B失活，而GSK3B活性降低導(dǎo)致糖原合成酶磷酸化水平降低，從而導(dǎo)致糖原合成酶活性升高，糖原合成增加[10]。PTP1B在胰島素抵抗（IR）發(fā)生時表達顯著升高，通過作用于胰島素受體及其底物，減弱或終止胰島素信號傳導(dǎo)，產(chǎn)生IR[11]。CPT1A對脂肪細胞中的游離脂肪酸誘導(dǎo)的IR起保護作用，且可以抑制JNK因子從而阻斷游離脂肪酸引起的IR效應(yīng)及炎癥反應(yīng)。同時CPT1A表達增加可顯著降低TG的含量[12-13]。LXR-α可以激活脂肪細胞生成大量超過體內(nèi)代謝能力的脂肪酸，導(dǎo)致脂肪堆積于肝臟引起肝細胞脂肪變性[14]。

西醫(yī)學(xué)研究認為IR、氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化可能是NAFLD發(fā)病過程中的重要環(huán)節(jié)。“二次打擊”學(xué)說認為IR是引起肝細胞脂質(zhì)積累并誘導(dǎo)機體對內(nèi)源性損害因子敏感性增加從而導(dǎo)致NAFLD的第一次打擊[15]。因此IR是NAFLD的主要致病機制，是脂肪變性向脂肪性肝炎、肝硬化發(fā)展的觸發(fā)因素并貫穿該病全過程[16]。它減弱胰島素對脂肪代謝的調(diào)節(jié)，脂肪組織分解加強，促進游離脂肪酸在肝細胞內(nèi)的沉積，導(dǎo)致肝細胞線粒體氧化超載，加重脂肪變性[17]。此外，增多的游離脂肪酸通過抑制胰島素信號傳導(dǎo)，減少胰島素清除，從而加重IR[18]?；诩t花對IR通路的調(diào)節(jié)作用及IR通路在NAFLD發(fā)病機制中的重要作用，提示了紅花治療NAFLD的可能性。

4 結(jié)論

研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略對紅花進行化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、靶點預(yù)測，為紅花的進一步研究提供了更多可能性。構(gòu)建了紅花成分-靶點-信號通路圖，展示了紅花治療NAFLD具有多成分、多靶點、多信號通路的特點。分析了GO生物過程和KEGG通路富集，提示紅花治療NAFLD的作用可能與胰島素抵抗相關(guān)。對全面、深入探索紅花治療NAFLD的可能性具有重要的參考意義。研究僅是借用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對紅花治療NAFLD進行了數(shù)據(jù)庫的分析研究，其研究結(jié)果仍需要進一步的實驗驗證。