珠江下游浮游細菌群落結構的時空分布特征*

杜宛璘，孫金輝，麥永湛，賴子尼，賈慧娟,3，葛大艷,4，王 超

(1：中國水產科學研究院珠江水產研究所，廣州 510380)(2：天津農學院，天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)(3：上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306)(4：上海海洋大學生態(tài)與環(huán)境學院，上海 201306)

河流具有高度的環(huán)境異質性和微生物群落多樣性，是碳氮等元素轉化的重要場所. 浮游細菌作為河流生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分在河流生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[1]，其中包括固氮、脫氮、固碳、硫化物氧化[2]和降解水體污染物[3]等多種功能. 已有研究表明，河流浮游細菌群落組成受時間、空間、溫度、氮、磷、pH、溶解氧等[4-5]環(huán)境因子的影響，在時空分布上呈現顯著差異，而細菌群落組成差異又決定了細菌群落在河流生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮不同的功能. 因此，闡明浮游細菌群落時空分布及其環(huán)境響應機制，有助于深入了解河流內部環(huán)境變化規(guī)律，揭示細菌群落組成與河流生態(tài)系統(tǒng)功能之間的關系. 目前有很多學者對河流生態(tài)系統(tǒng)中的浮游細菌群落進行了研究，例如九龍江[4]、密西西比河[6]、長江[7]、東江[8]等，然而迄今為止，有關我國珠江下游浮游細菌群落的研究仍鮮有報道.

珠江是中國南方最大的水系，是中國境內第三長河流. 珠江是沿江地區(qū)人們生活、農業(yè)、工業(yè)用水的主要來源[9]. 珠江下游流經人口密集、經濟發(fā)達的珠三角城市群和粵港澳大灣區(qū)，常年受工農業(yè)污染以及居民生活污水排放的影響，珠江下游生態(tài)環(huán)境遭到嚴重破壞. 近年研究表明，珠江流域不同地區(qū)都存在污染物濃度逐年升高的趨勢[10]，且珠江下游河網區(qū)域重金屬污染程度較高[11]，這極大限制了珠江水資源的可持續(xù)利用. 目前有關珠江流域生態(tài)環(huán)境的相關研究主要涉及土壤[12]、水質[13]、浮游植物[14]和底棲動物[15]，有關浮游細菌群落的研究相對較少.

高通量測序技術因其快速、準確、大批量、并且免于實驗室培育等優(yōu)點[16-17]，已經成為環(huán)境微生物學和微生物生物地理學的主要研究技術手段，并被廣泛應用于濕地、土壤和生物膜等復雜環(huán)境中微生物群落結構的研究[18-20]. 本文采用16S rDNA擴增子測序方法對珠江下游采集的水體樣品進行高通量測序，結合多種生信統(tǒng)計方法，探索珠江下游浮游細菌群落動態(tài)變化，以期更全面地了解珠江下游水體狀況. 我們假設，珠江下游浮游細菌受環(huán)境因子影響將在群落結構上呈現明顯差異，這種差異有助于確定珠江下游浮游細菌群落與環(huán)境特征之間的關系. 因此，本文旨在了解珠江下游浮游細菌群落多樣性及分布情況；確定影響浮游細菌群落多樣性及分布的關鍵驅動因子，為珠江流域水生生態(tài)環(huán)境保護以及珠江水域污染的生態(tài)預警，提供科學資料和理論依據.

1 材料與方法

1.1 調查時間和站位

于2016年6月(豐水期)和2016年12月(枯水期)對珠江下游水域進行野外調查. 在該水域共布設16個采樣站位，基本覆蓋了西江沿線、珠三角河網中部和廣州市周邊，具體站位如圖1所示. 包括封開(FK)、德慶(DQ)、肇慶(ZQ)、青岐(QQ)、左灘(ZT)、外海(WH)、新圍(XW)、小欖(XL)、小塘(XT)、北滘(BJ)、欖核(LH)、橫瀝(HL)、陳村(CC)、市橋(SQ)、蓮花山(LHS)、珠江橋(ZJQ). 其中封開、德慶、肇慶、青岐、左灘、外海、新圍位于西江沿線，小欖、小塘、北滘、欖核、橫瀝、陳村和市橋位于珠三角河網中部，珠江橋和蓮花山位于廣州市周邊.

圖1 珠江下游調查部位分布Fig.1 Sampling sites in the downstream of Pearl River

1.2 樣品采集與處理

使用5 L有機玻璃采水器采集表層(距離水面0.5 m)水樣3 L. 其中2 L水樣采集后立即轉移到無菌取樣袋中(TWIRL EM?，LABPLAS INC.，Quebec，Canada)，放于4℃冰箱下冷藏，盡快運回實驗室. 取1.5 L水樣等分為3份(生物學重復，避免誤差)，分別經200 μm尼龍膜(NY-05，Switzerland)初濾去除大型浮游生物和雜質，再通過0.22 μm孔徑的聚碳酸酯濾膜(PALL，USA)過濾，并迅速將濾膜轉移至10 mL無菌離心管，保存在-80℃條件下用于DNA提取. 其余樣品等分為2份，一份經0.45 μm孔徑醋酸纖維素濾膜(Whatman，USA)過濾后保留水樣；另一份按照《水質樣品的保存和管理技術規(guī)定》(HJ 493-2009)標準加入固定劑于4℃保存，用于水化學分析.

1.3 環(huán)境因子數據收集

1.4 DNA提取、聚合酶鏈式反應(PCR)和高通量測序

水體樣品總DNA采用DNeasy PowerWater?Kit試劑盒(MO BIO Laboratories，United States)提取，按照生產商提供的說明書進行操作. 用分光光度計(NanoDrop ND-2000，USA)檢測DNA純度和濃度，并通過1% 瓊脂糖凝膠電泳進行觀察. 利用515正向引物(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和806反向引物(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[21]擴增細菌16S rRNA基因的V4高變區(qū). 在含有10 μL 5× TransStart?FastPfu Fly緩沖液，5 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，2 μL正向引物(5 μmol/L)，2 μL反向引物(5 μmol/L)，1 μL TransStart?FastPfu Fly DNA 聚合酶，2.5 μL 模板DNA(25 ng)和27.5 μL ddH2O的50 μL PCR混合物中構建擴增子文庫. PCR反應條件為：95℃ 1 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，共27個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應. 對每份樣品所制備的一式3份的PCR產物等體積混合，進一步通過1%瓊脂糖凝膠檢測PCR產物純化效果，最后在Illumina二代測序平臺(Illumina Inc，CA，USA)進行測序.

1.5 生信分析

雙向測序完成后下機的測序片段(reads)經FLASH(version 1.2.11)[22]組裝，并由QIIME(version 1.8.0)[23]拼接. 本文利用UCHIME(version 4.1)[24]識別并去除嵌合序列(chimeric sequences)，由UPARSE(version 7.0.1001)[25]進行可操作分類單元(OTU，operational taxonomic units)聚類(序列一致性設定為97%)，以0.8置信度閾值對OTU進行注釋，并將所有葉綠體、真核生物、未知序列以及OTU單體(singleton)去除.

通過RStudio程序包vegan的diversity函數計算香農-威爾指數(Shannon-Wiener index)和Chao 1指數(Chao 1 index). 采用非度量多維尺度(NMDS，nonmetric multidimensional scaling)和相似性分析(ANOSIM，analysis of similarities)方法分析細菌群落組間差異及時空分布特征. 基于群落Bray-Curtis相異度，采用RStudio程序包vegan和grid進行CCA/RDA分析，評估細菌與環(huán)境因子之間的關系.

1.6 功能預測分析

使用PICRUSt軟件，基于OTU的物種注釋和豐度信息，將KEGG數據庫中已有基因組的原核生物16S rRNA序列與SILVA[26]數據庫中16S rRNA序列進行關連，然后將KEGG數據庫已有的原核物種基因組進行序列打斷，利用UProC(version 1.2.0)對所有基因組的KO序列進行統(tǒng)計. 最后利用16S的拷貝數對物種數目進行校正，最終實行KEGG預測以及KO豐度統(tǒng)計，從而獲得所測基因的功能預測信息. 原始數據上傳到NCBI-SRA數據庫，登陸號：PRJNA550236.

2 結果與分析

2.1 珠江下游水體理化特征

2.2 珠江下游浮游細菌群落結構組成

測序結果顯示，質量過濾后，珠江下游16個站位所采集的48個表層水樣品，一共獲得4389036個有效reads，并注釋268004個OTUs，平均每個樣本的OTU數目為3125±1632.

在門分類水平上，檢測到的前15個門類，季節(jié)特征顯示變形菌(Proteobacteria)在豐水期和枯水期均為最優(yōu)勢門類(圖2)，相對百分比分別為50.04%和52.62%. 此外，豐水期優(yōu)勢門類的多樣性高于枯水期，除了兩個季節(jié)均占優(yōu)勢的變形菌、放線菌(Actinobacteria)和擬桿菌(Bacteroidetes)外，厚壁菌(Firmicutes)和藍細菌(Cyanobacteria)在豐水期的個別站位也會形成較大的優(yōu)勢(圖2A). 空間特征顯示，變形菌在豐水期的空間分布呈現河網中部的相對豐度高于西江沿線和廣州市周邊(圖2A)，而其在枯水期的空間分布則呈相反趨勢(圖2B). 此外，厚壁菌在豐水期的西江沿線和河網中部的個別站位，相對豐度會超過變形菌(圖2A).

在綱分類水平上，β-變形菌(Betaproteobacteria)在豐水期和枯水期均為最優(yōu)勢菌綱(圖3)，相對百分比分別為27.89%和25.62%. 此外，豐水期特有的優(yōu)勢菌綱有芽孢桿菌(Bacilli)和藍細菌(Cyanobacteria)(圖3A)，而枯水期特有的優(yōu)勢菌綱有黃桿菌(Flavobacteriia)和ε-變形菌(Epsilonproteobacteria)(圖3B). 空間特征顯示，豐水期放線菌呈西江沿線>河網中部>廣州市周邊的趨勢，α-變形菌(Alphaproteobacteria)、 γ-變形菌(Gammaproteobacteria)和芽孢桿菌在西江沿線和河網中部個別站位成為最優(yōu)勢菌綱(圖3A)，藍細菌在廣州市周邊站位相對豐度明顯升高；枯水期β-變形菌在西江沿線的相對豐度波動較大，而在河網中部和廣州市周邊站位較穩(wěn)定(圖3B).

2.3 珠江下游細菌群落結構多樣性

Shannon-Wiener 指數和Chao 1指數分析結果顯示，珠江下游浮游細菌群落的季節(jié)差異不明顯，豐水期略高于枯水期(圖4).

表1 珠江下游表層水體環(huán)境特征

采用基于歸一化OTUs豐度的NMDS分析方法，并結合ANOSIM的R值進行β多樣性分析. ANOSIM是顯示組間差異和組內差異的一個參數. β多樣性分析結果表明，珠江下游浮游細菌群落結構在空間尺度上無顯著差異(R=0.033，P=0.331)，而在時間尺度上呈現顯著性差異(R=0.222，P=0.001). 所有站位被分為4組，豐水期和枯水期可以明顯區(qū)分開，組1和組3為豐水期站位，組2和組4除豐水期的青岐和市橋兩個站位外，均為枯水期站位(圖5). 其次每個季節(jié)在空間上可以分為兩個組群，豐水期的組1站位位于西江三角洲，組3位于北江三角洲；枯水期的組2大部分站位位于廣州市周邊，組4大部分位于西江沿線和珠三角河網中部.

圖2 珠江下游浮游細菌豐水期(A)和枯水期(B)各門的相對豐度(FK.Jun：封開豐水期；FK.Dec：封開枯水期；其他類同)Fig.2 Relative abundance of each phylum of bacterioplankton in wet season(A)and dry season (B)in the downstream of Pearl River

圖3 珠江下游浮游細菌豐水期(A)和枯水期(B)各綱的相對豐度(FK.Jun：封開豐水期；FK.Dec：封開枯水期;其他類同)Fig.3 Relative abundance of each class of bacterioplankton in wet season(A) and dry season (B)in the downstream of Pearl River

圖4 珠江下游浮游細菌Shannon-Wiener(A)和Chao 1(B)多樣性指數Fig.4 Shannon-Wiener(A) and Chao 1(B)indexes of bacterioplankton along the downstream of Pearl River

圖5 珠江下游浮游細菌群落NMDS分析(Jun_ZJQ：豐水期珠江橋，其余類同)Fig.5 NMDS analysis of bacterioplankton community in the downstream of Pearl River

2.4 珠江下游細菌群落結構的環(huán)境驅動因子

圖6 珠江下游浮游細菌群落與環(huán)境因子的RDA分析(Jun_FK：豐水期封開，其余類同；綠色站位代表豐水期站位，粉色站位代表枯水期站位)Fig.6 RDA analysis between bacterioplankton community and environment factors in the downstream of Pearl River

圖7 珠江下游浮游細菌前15綱與環(huán)境因子的RDA分析Fig.7 RDA analysis between the first 15 classes of bacterioplankton community and environment factors in the downstream of Pearl River

2.5 珠江下游浮游細菌群落功能預測分析

功能預測結果(熱圖)顯示，空間分布上大多數樣品中，功能譜的相對豐度是相似的. 轉運體(Transporters)、ABC轉運體 (ABC transporters)、DNA修復和重組蛋白 (DNA repair and recombination proteins)和雙組分系統(tǒng)(two-component system)等是珠江下游浮游細菌群落所表達的主要功能. 季節(jié)分布上，豐水期所有站位的相對豐度高于枯水期，其中轉運體和ABC轉運體的相對豐度豐水期明顯高于枯水期 (圖8).

圖8 豐水期(A)和枯水期(B)細菌功能預測相對豐度熱圖Fig.8 Heat map of bacterial function prediction relative abundance in wet season(A) and dry season(B)

3 討論

珠江下游浮游細菌群落結構組成顯示，在門分類水平上，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和藍細菌門是珠江下游的優(yōu)勢菌門. 國內外大型江河生態(tài)系統(tǒng)的研究結果(表2)與本研究的結果一致. 在綱分類水平上，β-變形菌、放線菌、α-變形菌和γ-變形菌的相對豐度在兩個季節(jié)均排名前四位，這與國內外多數淡水生態(tài)系統(tǒng)的調查結果也是一致的[27-30].

本研究結果顯示，浮游細菌群落相似性組成的季節(jié)間差異明顯，NMDS結果可以將豐水期和枯水期明顯區(qū)分開(圖5). 綱水平的相對豐度圖顯示(圖3)，芽孢桿菌和黃桿菌在兩個季節(jié)分布差異較明顯. RDA分析的結果顯示，WT和SD是影響季節(jié)間差異的重要因素(圖6). Lv等[31]在黃河三角洲，以及Ma等[32]對海河的研究均表明，溫度是導致細菌群落結構季節(jié)性變化的一個主要原因. 分析認為，由于每種細菌群落都有自己的最適溫度范圍，且溫度可影響細菌的生長速率和新陳代謝[33-35]，豐水期水溫高，適宜細菌生長，而枯水期水溫相對較低，會抑制細菌的增殖和代謝[36]，從而抑制細菌生長. 芽孢桿菌最適生長溫度為37℃[37]，而此次采樣的WT范圍為18.0～33.8℃，還未達到芽孢桿菌的最適溫度，因此隨著WT的升高，芽孢桿菌增加. 而黃桿菌的最適生長溫度為25℃[38]，低于芽孢桿菌的最適生長溫度，因此兩者呈現出的結果不同. 除WT的影響外，Jeon等[39]研究發(fā)現，厚壁菌門中的芽孢桿菌綱是沙塵細菌的優(yōu)勢菌群. 豐水期，大量降雨將山體泥沙和岸邊泥沙卷入河流地表水中，沙塵細菌的引入從而導致芽孢桿菌綱相對豐度顯著提高. 而黃桿菌綱屬擬桿菌門，擬桿菌門被認為可以降解高分子量有機化合物[40]，枯水期降雨量減少，雨水對河流的稀釋度降低，導致人為輸入的有機物含量相對增加，因此促進了黃桿菌綱的增加. 然而，相對豐度較高的細菌種群在兩個季節(jié)的差異不明顯. 分析原因在于：(1)兩個季節(jié)的水溫差異不大，平均值相差小于10℃. 寇文伯等[41]對鄱陽湖浮游細菌的研究發(fā)現，7月和10月的水溫差異不大，浮游細菌群落的群落結構組成變化也不大. (2)豐水期頻繁降雨導致徑流量增大，水體混合程度高，透明度降低，這有助于大量附著細菌進入表層水體，造成細菌多樣性和豐度增加；然而，徑流量增大對浮游細菌群落也會產生稀釋作用，導致多樣性和豐度減??；枯水期徑流量小，稀釋作用減弱，但是透明度增大對浮游細菌產生的沉降損失作用增強. 因此從整體上看細菌群落組成變化顯著，但相對豐度較高的細菌種群較穩(wěn)定，所占比例并沒有發(fā)生顯著變化.

功能預測分析表明，轉運體、ABC轉運體、DNA修復和重組蛋白、雙組分系統(tǒng)在細菌功能預測中排名前四. 轉運體和ABC轉運體均為細胞膜上的一種蛋白，參與跨膜運輸功能. 其中ABC轉運體在細菌中可參與營養(yǎng)物質的攝取或細菌毒素的分泌[52]. DNA修復蛋白可隨時糾正和修復損傷，保持DNA結構、功能完整性[53]；DNA重組又可參與DNA修復，并維持遺傳的多樣性[54]. 雙組分系統(tǒng)信號轉導機制，可應對多種環(huán)境變化、代謝和細胞周期信號，感應 pH、養(yǎng)分、氧化還原狀態(tài)、滲透壓力和抗生素的雙組分系統(tǒng)等[55]. Lv等[31]對黃河三角洲功能預測分析表明，低溫細菌群落功能受損. 本研究結果同樣顯示出，豐水期所有站位的相對豐度高于枯水期，其中轉運蛋白和ABC轉運蛋白的差異明顯. 分析原因(1)枯水期溫度低，浮游細菌數量低于豐水期，從而導致功能預測豐度降低. (2)轉運蛋白是一種蛋白質，ABC轉運蛋白是一種ATP酶，溫度降低會抑制蛋白質和酶的活性，微生物群落在低溫下活性也較低，降低了微生物代謝[56].

表2 國內外基于16S rRNA測序的河流細菌群落組成及影響因子研究結果*

*-表示文獻中未進行細菌群落影響因子的研究.

4 結論

1)珠江下游浮游細菌主要菌門為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、疣微菌門和藍細菌門. 優(yōu)勢菌綱為β-變形菌綱、放線菌綱、α-變形菌綱、γ-變形菌綱、芽孢桿菌綱和黃桿菌綱.

2)珠江下游浮游細菌群落結構存在季節(jié)和空間變化，多樣性指數豐水期高于枯水期，空間分為3個區(qū)域：西江沿線、珠三角河網中部和廣州市周邊.

4)功能預測分析表明，轉運體(Transporters)、ABC轉運體(ABC transporters)、DNA修復和重組蛋白(DNA repair and recombination proteins)、雙組分系統(tǒng)(two-component system)、嘌呤代謝(Purine metabolism)等是珠江下游浮游細菌群落所表達的主要功能，其中轉運體和ABC轉運體豐水期明顯高于枯水期.