先天性雙側(cè)輸精管缺如患者睪丸組織中CFTR 蛋白的表達(dá)及意義

白 松 吳 斌

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 泌尿外科（遼寧沈陽(yáng) 110004）

前 言

先天性雙側(cè)輸精管缺如 （Congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD,OM IM 277180） 是導(dǎo)致男性不育的重要原因[1]，約占男性不育的2%～6%，占梗阻性無精子癥的25%， 是常見的常染色體隱性遺傳疾病，發(fā)病率為1/1000。 臨床一般表現(xiàn)為雙側(cè)輸精管缺如、精液量減少、精囊及附睪尾發(fā)育不良或缺失[2]。 目前的治療方法主要為經(jīng)附睪或睪丸取精聯(lián)合卵泡漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)以達(dá)到生育目的。

CFTR 基 因 （Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,OM IM 602421）編碼一種ATP 依賴的跨膜蛋白，具有介導(dǎo)氯離子、碳酸氫根離子和水分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，在呼吸道、消化道和生殖道的上皮細(xì)胞多有表達(dá)。CFTR 基因突變可以導(dǎo)致CBAVD 的發(fā)生，但是CFTR 基因突變對(duì)CBAVD 患者睪丸生精功能是否造成影響， 相關(guān)研究較少而且一直備受爭(zhēng)議，CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達(dá)情況也未見報(bào)道。

本研究通過對(duì)66 例CBAVD 患者的睪丸穿刺組織行CFTR 蛋白免疫組化檢測(cè)和睪丸生精功能評(píng)價(jià)，旨在探索我國(guó)CBAVD 患者睪丸組織中CFTR 蛋白的表達(dá)與睪丸生精功能的關(guān)系。

材料和方法

一、標(biāo)本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在盛京醫(yī)院就診的66名CBAVD 患者為實(shí)驗(yàn)組； 實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本來自睪丸穿刺活檢術(shù)，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過盛京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組患者均簽署知情同意書。CBAVD 患者納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：1.觸診雙側(cè)精索未觸及輸精管，睪丸大小正常（Prader 睪丸模型＞12m L）， 兩名?？漆t(yī)師同時(shí)查體；2. 無囊性纖維化其它癥狀，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；3.精液分析檢查至少3 次，無精子，射精后尿液沉淀后也未見精子以除外逆行射精， 精液量＜1.5m L，PH＜6.4，精漿果糖＜13umol/m l 和ɑ-糖苷酶＜20umol/m L；4. 超聲示附睪頭飽滿，呈網(wǎng)格狀，可伴有附睪尾和精囊的缺失或發(fā)育不良；5. 性激素水平正常；6. 染色體正常；7. 行TESE-ICSI 輔助生殖；8.無家族遺傳疾病。

二、取材、石蠟包埋和免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

取材：術(shù)區(qū)消毒鋪無菌單，局麻成功后，使用18G穿刺活檢針（Bard，美國(guó)）取睪丸組織2 條，大小約0.5×0.08cm，將其中1 條組織進(jìn)行石蠟包埋；固定：4%多聚甲醛固定24h；沖洗：流水沖洗24h；脫水和透明：80%乙醇2h →90%乙醇2h →95%乙醇40min →無水乙醇40m in →二甲苯10m in →二甲苯10m in；浸蠟：軟蠟1h→軟蠟1h→硬蠟1h；包埋：生物組織包埋機(jī)包埋，制成蠟塊；石蠟切片，厚度3um，然后放入烤箱65℃，4h；常規(guī)脫蠟，水化：二甲苯20min →二甲苯20min →無水乙醇10min →95%乙醇10min →90%乙醇10min →80%乙 醇10min；3%H2O2孵 育10m in，PBS 沖 洗，3 次×3min；高溫高壓抗原修復(fù)3min，自然冷卻；滴加1:400稀釋的CFTR 兔抗人多克隆抗體 （RLTO888， 睿瀛生物， 中國(guó)），4℃放入濕盒內(nèi)過夜；PBS 沖洗，3m in×3 次，滴加HRP 辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體 （PV-6000 18m l， 北京中杉金橋， 中國(guó)），37℃孵育30m in；PBS 沖洗，3m in×5 次，DAB 顯色劑顯色，結(jié)合顯微鏡檢查（E800 Nikon，日本），3-5m in，顯色合格后自來水沖洗終止染色；蘇木素復(fù)染3min；流水充分沖洗反藍(lán)10m in；脫水，二甲苯透明：80%乙醇10m in →90%乙醇10m in →95%乙醇10min →無水乙醇10min →二甲苯20m in →二甲苯20min；中性樹膠封片。

陽(yáng)性對(duì)照使用附睪組織， 空白對(duì)照用PBS 替代CFTR 兔抗人多克隆抗體。

三、免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

使用Nikon E800 顯微鏡及NIS-Elements F4.3 軟件采集圖像。 CFTR 蛋白免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：兩名病理科醫(yī)師同時(shí)單獨(dú)閱片， 對(duì)于有爭(zhēng)議的結(jié)果討論后再?zèng)Q定，每個(gè)標(biāo)本觀察5 個(gè)20×10 高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)視野的百分比：≦5%、5-25%、26-50%、51-75%和76-100%分別記錄為0、1、2、3 和4 分； 著色程度：無著色、淡黃、棕黃和棕褐色分別記錄為0、1、2 和3 分，兩者相乘結(jié)果為最后得分， 根據(jù)得分：0、1-4 分、5-8 分和9-12 分分別記錄為陰性-、弱陽(yáng)性+、陽(yáng)性++和強(qiáng)陽(yáng)性級(jí)+++。

四、睪丸生精功能障礙Johnsen 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

10 分：精子發(fā)生功能完整，精子放出正常；9 分：精子發(fā)生功能減低，精子放出少見；8 分：精子發(fā)生功能減低，精子放出不可見；7 分：精子細(xì)胞分化障礙，多數(shù)未成熟的精子細(xì)胞；6 分：精子細(xì)胞分化障礙，少數(shù)未成熟的精子細(xì)胞；5 分：初級(jí)精母細(xì)胞成熟受阻，多數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞；4 分：初級(jí)精母細(xì)胞成熟受阻，少數(shù)初級(jí)精母細(xì)胞；3 分：精原細(xì)胞阻滯；2 分：唯支持細(xì)胞綜合征；1 分：生殖道萎縮。

五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 22.0 軟件，Kendall'tau-b 相關(guān)系數(shù)，P＜0.05 認(rèn)為有意義。

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

CFTR 蛋白在睪丸支持細(xì)胞和生精細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，著色主要位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜，具體見圖1。

圖1 CFTR 蛋白免疫組化在睪丸組織中的表達(dá)

二、CBAVD 患者睪丸組織CFTR 蛋白表達(dá)情況

CBAVD 患者CFTR 蛋白在睪丸生精上皮及支持細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性、 陽(yáng)性、 弱陽(yáng)性和陰性分別為：5(7.59%)、33(50.00%)、25(37.87%)和3(4.54%)。

三、CBAVD 患者睪丸生精功能評(píng)分

CBAVD 組患者睪丸生精Johnsen 評(píng)分7-10 分的比例分別為3 (4.45%)、27 (40.9%)、28 (42.42%) 和8(12.23%)。

四、CFTR 蛋白表達(dá)與睪丸生精功能評(píng)分的相關(guān)性

Kendall'tau-b 等級(jí)相關(guān)分析顯示，睪丸內(nèi)CFTR 蛋白表達(dá)水平與生精功能呈強(qiáng)正相關(guān)性，CBAVD 組Kendall'tau-b=0.785，P＜0.01。

討 論

1989 年Riordan 等首先克隆了CFTR 基因的cDNA 片段并鑒定了其產(chǎn)物CFTR 蛋白[4]， 該基因位于7q31.2[5]，全長(zhǎng)250kb，有27 個(gè)外顯子，mRNA 序列長(zhǎng)度6128bp，編碼CFTR 蛋白，由1480 個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為168kDa[6]。

CFTR 蛋白屬于cAMP 依賴的跨膜蛋白質(zhì)[7]，位于上皮細(xì)胞頂膜， 主要為氯離子跨上皮運(yùn)動(dòng)提供選擇性通道，此外對(duì)鈉離子、碳酸氫鹽和水分子的跨膜流動(dòng)也具有重要的作用。 廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和汗腺等組織中， 以維持人體的電解質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 根據(jù)CFTR 蛋白缺失的程度可以有不同的臨床表型，包括囊性纖維化（OM IM 219700,cystic fibrosis,CF）、 高氯性的汗液分泌、 彌散性支氣管擴(kuò)張（OM IM 211400）、CBAVD 和急性或慢性反復(fù)復(fù)發(fā)性胰腺炎（OM IM 167800）等[8]。

精子的發(fā)生非常復(fù)雜， 由多潛能干細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂最后發(fā)育成精子，受到卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和雄激素(T)等多種激素的調(diào)節(jié)，這一過程發(fā)生在睪丸曲細(xì)精管及支持細(xì)胞內(nèi)。CFTR 蛋白在人類生殖系統(tǒng)有表達(dá)，可能對(duì)睪丸的生精微環(huán)境有重要作用，但是CBAVD 患者睪丸生精功能是否受到影響， 研究較少而且一直備受爭(zhēng)議，因?yàn)檠芯拷Y(jié)果大相徑庭，從正常到嚴(yán)重的無精癥均有報(bào)道[9,10]。

Li 等[11]研究發(fā)現(xiàn)CBAVD 患者睪丸內(nèi)精子細(xì)胞頭部畸形，線粒體鞘缺失和頂體內(nèi)陷，支持細(xì)胞內(nèi)降解小體增多，細(xì)胞之間連接疏松。 Hui 等[12]在敲除CFTR 基因小鼠的睪丸中，發(fā)現(xiàn)生精細(xì)胞停止更新，最終會(huì)導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征， 認(rèn)為CFTR 基因可能是通過HCO3-/sAC/cAMP/CREB 通路和NF-kB/COX-2/PGE2通路來調(diào)節(jié)睪丸生精功能。Lu 等[13]研究也發(fā)現(xiàn)CBAVD患者行輔助生殖時(shí)伴有更高的失敗風(fēng)險(xiǎn)。

目前在CBAVD 患者中，CFTR 基因突變?cè)趯?dǎo)致CBAVD 的同時(shí)，是否會(huì)影響睪丸的生精功能以及睪丸組織內(nèi)CFTR 蛋白的表達(dá)情況未見相關(guān)研究。

本研究首次報(bào)道了我國(guó)CBAVD 患者睪丸內(nèi)CFTR 蛋白的表達(dá)情況及睪丸生精功能情況。免疫組化結(jié)果顯示CFTR 蛋白可同時(shí)表達(dá)于睪丸內(nèi)的支持細(xì)胞及曲細(xì)精管的生精上皮細(xì)胞， 著色主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。CFTR 蛋白在睪丸生精上皮及支持細(xì)胞的表達(dá)以陽(yáng)性和弱陽(yáng)性為主，約占87.87%（58/66），且有3 例為陰性。 這表明部分CBAVD 患者睪丸內(nèi)生精上皮及支持細(xì)胞的CFTR 蛋白表達(dá)下降，而CFTR 蛋白是重要的離子和液體通道， 對(duì)睪丸生精功能非常重要， 所以CFTR 蛋白表達(dá)的減少也可能會(huì)對(duì)CBAVD 患者的睪丸生精功能造成傷害。

CBAVD 患者中睪丸生精Johnsen 評(píng)分8 分及以下的生精功能障礙患者比例達(dá)45.45%（30/66）， 甚至有3例患者僅為7 分，睪丸內(nèi)未見精子，導(dǎo)致無法行輔助生殖。 同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達(dá)與生精功能 Johnsen 評(píng)分有強(qiáng)正相關(guān)性，Kendall'tau-b 等級(jí)相關(guān)系數(shù)為0.785。 這表明CFTR 蛋白在睪丸組織中表達(dá)水平下降可能是影響睪丸生精功能的原因之一。

可見CFTR 基因在多個(gè)方面廣泛的影響著男性生育，不僅會(huì)導(dǎo)致雙側(cè)輸精管缺如，同時(shí)還會(huì)引起睪丸內(nèi)CFTR 蛋白表達(dá)的減少，進(jìn)而對(duì)睪丸的生精功能造成影響，這對(duì)睪丸取精行ICSI 輔助生殖技術(shù)來說是一個(gè)挑戰(zhàn)。

結(jié)論

CBAVD 患者睪丸內(nèi)的CFTR 蛋白表達(dá)以陽(yáng)性和弱陽(yáng)性為主， 可表達(dá)于睪丸內(nèi)支持細(xì)胞及生精上皮細(xì)胞，以細(xì)胞膜和細(xì)胞漿為主；部分CBACD 患者存在生精功能障礙，CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達(dá)水平與生精功能存在強(qiáng)正相關(guān)性。