氟喹諾酮混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制

周劍，張麗媛，王敏，楊夢瑞，王彤彤

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081)

恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、沙拉沙星(SAR)、達(dá)氟沙星(DAN)、氧氟沙星(OFL)、培氟沙星(PFL)、諾氟沙星(NFX)、洛美沙星(LFL)屬于氟喹諾酮類藥物(FQs)，是喹諾酮藥物發(fā)展到第三代的產(chǎn)物，具有殺菌效果好、抗菌譜廣、機體吸收快等優(yōu)點［1］，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動物疾病［2–3］。但使用過量或者使用不當(dāng)會導(dǎo)致動物源性食品中藥物殘留［4］，如進(jìn)入人體易造成人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等的損傷［5–6］，并產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性［7–9］。因此歐盟、北美等國均規(guī)定FQs 在動物源食品中的最高殘留限量不得超過10～400 μg／kg［10］。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也發(fā)布了《獸藥停藥期規(guī)定》和《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》，以規(guī)范FQs 的使用［11］。

目前喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有微生物法、理化檢測法和免疫檢測法等［11–12］。其中理化檢測法主要有電化學(xué)法［13］、高效液相色譜法［14–15］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［16–17］等。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也公布了基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法標(biāo)準(zhǔn)用于例行監(jiān)測工作，但檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性、可溯源性需要配套相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)才能得以保證［18］。

目前由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心研制的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、諾氟沙星和洛美沙星溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為單一成分標(biāo)準(zhǔn)溶液；而達(dá)氟沙星只有純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)暫無溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；培氟沙星還沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。這些單一成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純品或溶液，在日常使用時，需要進(jìn)一步稀釋為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再根據(jù)實驗需要稀釋成工作溶液。對于多種藥物同時檢測，還要配制成混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價格昂貴，每次實驗實際用量很小，造成極大浪費；同時，實驗室自行配制儲備液，不僅延長實驗準(zhǔn)備時間，還會引入不確定的誤差，影響實驗結(jié)果。因此研制均勻、穩(wěn)定性良好、可溯源的氟喹諾酮類混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠、節(jié)省實驗時間和經(jīng)濟成本，以及對國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測溯源體系的建立具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AD 型，日本島津公司；

質(zhì)譜儀：Triple QuadTM3500 型，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

核磁共振儀：Avance III 型，德國布魯克公司；

卡爾費休水分滴定儀：TOLEDO DL32 型，瑞士梅特勒–托利多公司；

分析天平：XS105 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

電子天平：UMX2 型，感量為0.001 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：X series 2 型，美國賽默飛世爾科技公司；

7 種氟喹諾酮藥物純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：基本信息見表1。

表1 7 種氟喹諾酮類藥物純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

培氟沙星：純度為92.19%，不確定度為1.00%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

氘代甲醇：純度為99.6%，美國西格瑪奧德里奇公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜儀

（1）測定培氟沙星原料的主成分純度。色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技公司)；流動相：流動相A 為20 mmol／L 醋酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，(流動相A 與流動相B 的體積比為45∶55)；洗脫方式：等度洗脫；流量：1 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測器波長：279 nm。

（2）測定8 種氟喹諾酮藥物混合溶液。色譜柱：Agilent Zorbax SB-Aq 柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國安捷倫科技公司)；流動相：流動相A 為20 mmol／L 醋酸銨+0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈，流動相C 為甲醇；流量：1 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測器波長：290 nm；梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI)；離子源電壓：4 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：172 kPa；碰撞氣壓力：55 kPa；霧化氣壓力：310 kPa；輔助氣壓力：310 kPa；掃描范圍：50～340 Da。

1.2.3 核磁氫譜儀

探頭溫度：20.25℃；掃描寬度：8 223.43 Hz；激發(fā)脈沖角度：30 度；脈沖序列：zg30；弛豫延遲時間：60 s；采樣時間：3.98 s；累計采樣次數(shù)：128 次；偏置頻率：2 464.51 Hz；接收增益：64.00；譜寬：20.00×10–6；縱向弛豫時間：8.5 s。

1.2.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀

射頻功率：1 450 W；霧化室溫度：2℃；等離子體氣：氬氣，流量為16 L／min；載氣：氬氣，流量為1.23 L／min；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.4 r／s；采樣深度：7.8 mm；同位素駐留時間：0.1 s。

1.3 原材料純度核驗

對于恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星7 種國家有證純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，直接采用其標(biāo)示量值和不確定度，對于非有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)培氟沙星，需要對其進(jìn)行定性和純度核驗。

1.3.1 定性分析

采用高效液相色譜–質(zhì)譜法和核磁氫譜法對培氟沙星純品進(jìn)行定性分析。

（1）高效液相色譜–質(zhì)譜法。將培氟沙星純品溶于甲醇中，配制成培氟沙星的質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的甲醇溶液，采用高效液相色譜–質(zhì)譜進(jìn)行全掃描分析。

（2）核磁氫譜法。將培氟沙星純品溶于氘代甲醇中，采用1H NMR 進(jìn)行氫譜分析。采樣前，調(diào)諧和勻場均先采用自動方式，取得初步信號，然后根據(jù)化合物信息，再手動調(diào)諧、勻場和調(diào)節(jié)增益。

1.3.2 定量分析

采用高效液相色譜–面積歸一化法測定培氟沙星原料的主成分純度。

1.3.3 雜質(zhì)定量方法

雜質(zhì)主要包括水分和無機離子。

水分定量采用卡爾費休水分儀進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱量5～10 mg 樣品，迅速加入至卡爾費休滴定池內(nèi)進(jìn)行滴定，輸入稱量質(zhì)量數(shù)，讀取水分值。為了消除空氣和操作過程中水分進(jìn)入滴定池對測定結(jié)果的影響，模擬加樣過程，測定實驗環(huán)境中水分值進(jìn)行空白扣除。每個樣品重復(fù)測定5 次，取平均值作為測量結(jié)果。

無機離子雜質(zhì)采用微波消解–電感耦合等離子體質(zhì)譜法進(jìn)行測定。稱取5 份樣品，取樣量均為1 g(精確至0.000 1 g)，置于微波消解管內(nèi)，在優(yōu)化的微波消解條件下進(jìn)行消解，待消解完全后，取出內(nèi)罐，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用水定容至標(biāo)線，混勻備用。同時做試劑空白。

1.3.4 8 種氟喹諾酮類藥物互為雜質(zhì)分析

8 種氟喹諾酮類藥物理化性質(zhì)十分接近，在藥物合成或提取過程中，單一組分可能會殘留微量同類物質(zhì)中的其它成分，因此應(yīng)計算并評估雜質(zhì)對主成分量值的影響。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

在(20±2)℃環(huán)境溫度下，采用重量–容量法配制氟喹諾酮類混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。分別準(zhǔn)確稱量8種氟喹諾酮類藥物各約50 mg，置于同一500 mL 容量瓶中，用甲醇定容至標(biāo)線，振蕩、混勻，配制成質(zhì)量濃度均為100 mg／L 的氟喹諾酮類混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

將配制好的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在(20±2)℃溫度下充分靜置，然后分裝至350 只2 mL 的潔凈棕色安瓿瓶中，分裝量為1.2 mL／瓶，編號后置于–18℃冰箱中冷凍保存。

1.5 均勻性檢驗

從已分裝好的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機抽取11 瓶樣品，按照1.2.1 中的色譜條件進(jìn)行均勻性檢驗。以另一瓶獨立樣品為基準(zhǔn)，每瓶樣品均重復(fù)測定3 次，測定順序隨機，取平均值作為測定結(jié)果，用方差分析法統(tǒng)計檢驗溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

1.6.1 長期穩(wěn)定性

長期穩(wěn)定性一般要求在一定時間內(nèi)測量點不少于5 個，本研究分別在第0，1，3，6，7 個月隨機抽取2 瓶樣品，采用與均勻性檢驗相同的色譜條件，對每瓶樣品平行測定3 次，并采用新配制溶液進(jìn)行單點法濃度定值，采用趨勢分析法對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行評估。

1.6.2 短期穩(wěn)定性

模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)運輸?shù)膶嶋H情況，設(shè)定了4，20，50℃3 個不同的溫度條件進(jìn)行短期穩(wěn)定性考察。分別在第1，3，5，7 d 隨機抽取2 瓶樣品，采用與長期穩(wěn)定性相同的方法對每瓶樣品平行測定3 次，采用趨勢分析法對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行評估。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料定性分析

2.1.1 高效液相色譜–質(zhì)譜法定性分析

采用高效液相色譜–質(zhì)譜法，在1.2.1 和1.2.2儀器工作條件下，對培氟沙星純品進(jìn)行定性分析。培氟沙星液相色譜–質(zhì)譜離子峰如圖1 所示。

圖1 培氟沙星液相色譜–質(zhì)譜離子峰

由圖1 提供的離子碎片信息可知，培氟沙星譜圖中有3 個明顯的質(zhì)譜峰，質(zhì)荷比分別為m／z=334.1，m／z=316.1，m／z=290.3，經(jīng)過與培氟沙星分子式進(jìn)行對比分析可知，3 個質(zhì)譜峰分別屬于[M+H]+，[M–OH+H]+，[M–COOH+H]+。此外，譜圖中其它信號峰響應(yīng)均較低。表明分析物為培氟沙星。

2.1.2 核磁氫譜法定性分析

在1.2.3 儀器工作條件下，對培氟沙星進(jìn)行核磁共振氫譜分析，培氟沙星一維核磁氫譜圖見圖2。

圖2 培氟沙星一維核磁氫譜圖

經(jīng)相位校正和基線校正分析發(fā)現(xiàn)，圖中化學(xué)位移為1.50×10–6的峰為1 位置甲基上氫的特征峰，2.21×10–6的峰為N 相連甲基上氫的特征峰，2.73～3.50×10–6的峰為培氟沙星上含兩個N 的六元環(huán)上―CH2―位置上氫的特征峰，8.01×10–6的峰為F 旁邊CH 位置上氫的特征峰，9.02×10–6的峰是N 旁邊CH 位置上氫的特征峰。與檢索軟件得到的培氟沙星圖譜進(jìn)行對比，兩圖譜中關(guān)鍵位置的特征峰化學(xué)位移均能一一對應(yīng)，表明分析物為培氟沙星。

2.2 原料定值分析

2.2.1 原料純度核驗

在1.2.1 和1.2.2 儀器工作條件下對培氟沙星進(jìn)行色譜分析，采用色譜峰面積歸一化法測定培氟沙星的純度。在1.2.4儀器工作條件下，采用微波消解–電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定金屬元素含量，用卡爾費休水分儀測定水分含量。圖3 為培氟沙星的液相色譜圖，培氟沙星純度核驗結(jié)果見表3。

圖3 培氟沙星的液相色譜圖(總圖和局部放大圖)

表3 培氟沙星純度核驗結(jié)果 %

由表3 可知，實驗驗證的培氟沙星純度為92.20%，證書上給定的純度為92.19%，不確定度為±1%，培氟沙星核驗純度與證書上的標(biāo)示值基本一致。因此可以采用原純品證書上的純度及不確定度。

2.2.2 原料互為雜質(zhì)分析

將每種氟喹諾酮類藥物配制成質(zhì)量濃度均為100 mg／L 的溶液，采用1.2.1（2）方法進(jìn)行測定。通過色譜圖比較每種藥物中雜質(zhì)的保留時間是否與另外7 種主成分相同，以此判斷雜質(zhì)是否為另外7種主成分，并通過面積歸一化得到的百分含量計算其對其它主成分量值的影響，結(jié)果見表4。

表4 原料互為雜質(zhì)分析結(jié)果

由表4 可知，諾氟沙星和達(dá)氟沙星中含有恩諾沙星，含量分別為0.03%和0.23%，因此恩諾沙星的量值應(yīng)為100.26 mg／L，對于恩諾沙星的量值100 mg／L 幾乎沒有影響。恩諾沙星中有環(huán)丙沙星，但含量僅為0.07%，因此環(huán)丙沙星的量值應(yīng)為100.07 mg／L，對于環(huán)丙沙星的量值100 mg／L 幾乎沒有影響。

2.3 均勻性檢驗

按照1.5 方法對研制的氟喹諾酮混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗，統(tǒng)計結(jié)果見表5。

表5 均勻性檢驗方差分析結(jié)果

查表得F0.05(10，22)=2.30，由表5 可知，8 種氟喹諾酮類藥物的F值均小于F0.05(10，22)，即在95%置信范圍內(nèi)，研制的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物的量值在瓶間和瓶內(nèi)不存在顯著性差異，樣品均勻性良好。

2.4 穩(wěn)定性檢驗

2.4.1 長期穩(wěn)定性

按照1.6.1 方法進(jìn)行長期穩(wěn)定性試驗，以檢測時間為自變量，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物含量為因變量進(jìn)行線性回歸，計算8 種氟喹諾酮類藥物擬合直線的斜率|β1|、截距β0、標(biāo)準(zhǔn)偏差平方s2、斜率不確定度s(β1)，結(jié)果見表6。

表6 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

查表得t0.95，3=3.18，由表6 可知，8 種氟喹諾酮類藥物的|β1|值均小于t0.95，3s(β1)，表明直線斜率不顯著，研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物在7個月內(nèi)的特征量值是穩(wěn)定的。

2.4.2 短期穩(wěn)定性

按照1.6.2 方法進(jìn)行短期穩(wěn)定性試驗，以檢測時間為自變量，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物的含量為因變量進(jìn)行線性回歸，計算8 種氟喹諾酮類藥物擬合直線的斜率|β1|、截距β0、標(biāo)準(zhǔn)偏差平方s2、斜率不確定度s(β1)，結(jié)果見表7。

表7 短期穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表7 可知，在20℃運輸條件下8 種氟喹諾酮類藥物的|β1|值均小于t0.95，3s(β1)，表明直線斜率不顯著，研制的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中8 種氟喹諾酮類藥物短期穩(wěn)定性良好，控制20℃以下的運輸條件，7 天內(nèi)量值穩(wěn)定。

2.5 不確定評定

氟喹諾酮混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度主要包括溶液配制過程引入的不確定度、均勻性引入的不確定度和穩(wěn)定性引入的不確定度。

2.5.1 溶液配制過程引入的不確定度

溶液配制過程引入的不確定度主要包括原料純度、稱樣質(zhì)量和定容體積引入的不確定度。

原料純度引入的不確定度由原料證書獲得，結(jié)果見表8。

稱樣質(zhì)量引入的不確定度主要來自稱量的變動性和天平校正?？梢酝ㄟ^天平的檢定證書獲得，天平重復(fù)性檢定結(jié)果分別為0.08 mg 和0.03 mg，假設(shè)正態(tài)分布，則換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差后將兩項合成得稱樣質(zhì)量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表8。

將原料純度、稱樣質(zhì)量和定容體積引入的不確定度合成得溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表8。

表8 溶液配制過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 %

2.5.2 均勻性引入的不確定度

均勻性引入的不確定度分量主要來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備過程、分裝以及實驗分析間的偏差。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性以獨立測量的平行試驗來表示，即以瓶間與瓶內(nèi)均勻性檢驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

式中：sH——瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差；

——組間方差；

——組內(nèi)方差；

n——組內(nèi)測量次數(shù)；

υ2——組內(nèi)自由度。

在這種情況下，sH等同于瓶間不均勻性引入的不確定度分量ubb，即公式ubb=sH。

將表5 中數(shù)據(jù)代入上式，計算得均勻性引入的不確定度，結(jié)果見表9。

2.5.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

根據(jù)ISO 導(dǎo)則35［19］，甲醇中8 種氟喹諾酮類藥物混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度u1ts由式(3)計算：

式中：s(β1)——穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)擬合直線斜率的相 對標(biāo)準(zhǔn)不確定度；

t——給定的保存期限。

分別將表6 和表7 中數(shù)據(jù)代入式(3)，計算得長期、短期穩(wěn)定性引入的不確定度，結(jié)果見表9。

2.5.4 總不確定度

將上述各不確定度分量合成得氟喹諾酮混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總不確定度和擴展不確定度(k=2，取整數(shù))，結(jié)果見表9

表9 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定評估結(jié)果 %

3 結(jié)語

以恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星7 種國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和經(jīng)純度核驗后的培氟沙星純品為原料，采用重量–容量法制備了甲醇中8 種氟喹諾酮藥物混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)?？疾炝? 種氟喹諾酮互為雜質(zhì)情況，利用高效液相色譜法進(jìn)行了均勻性檢驗與穩(wěn)定性檢驗，對配制過程中產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和評定。該混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已被批準(zhǔn)為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號為GBW(E) 083598，為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估中氟喹諾酮類藥物殘留測定提供了溯源保障。