MiR-197靶向JAK2調(diào)節(jié)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖侵襲能力的研究

[摘要]目的：探討miR-197通過調(diào)控JAK2對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431增殖和侵襲的影響。方法：收集2018年7月-2019年5月于筆者醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除且被證實(shí)為皮膚鱗狀細(xì)胞癌的組織標(biāo)本以及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本各40例，RT-qPCR檢測(cè)miR-197在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織、人正常皮膚細(xì)胞系HaCaT、人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC中的表達(dá)情況;Western-Blot檢測(cè)JAK2在各細(xì)胞株中的表達(dá);生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-197和JAK2的靶向關(guān)系;MTS法檢測(cè)miR-197對(duì)A431增殖能力的影響;Transwell檢測(cè)miR-197對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲能力的影響;IFA檢測(cè)miR-197對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子N-cadherin表達(dá)的影響。結(jié)果：miR-197在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431中的表達(dá)水平分別高于癌旁組織和人正常皮膚細(xì)胞系HaCaT，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系A(chǔ)431-miR-197-siRNA中miR-197、JAK2的表達(dá)水平均顯著下降（P<0.05）。經(jīng)Target Scan數(shù)據(jù)庫分析發(fā)miR-197和JAK2有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。下調(diào)miR-197能顯著降低皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，同時(shí)抑制N-cadherin的表達(dá)水平。結(jié)論：下調(diào)miR-197能夠靶向抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌中JAK2的表達(dá)和降低EMT相關(guān)分子N-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程以及增殖侵襲能力。

[關(guān)鍵詞]miR-197;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌;癌旁組織;HaCaT;JAK2;增殖;侵襲;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

[中圖分類號(hào)]R73? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2020）02-0074-05

Abstract： Objective? To investigate the effect of miR-197 on proliferation and invasion of human skin squamous cell carcinoma cell A431 by regulating JAK2. Methods? Forty specimens of skin squamous cell carcinoma and forty specimens of corresponding paracancerous tissues were collected from July 2018 to May 2019. The expressions of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue paracancerous tissue， human normal skin cell line HaCaT， human skin squamous cell carcinoma cell lines A431， A431-miR-197-siRNA and A431-miR-197-siRNA-NC were detected by RT-qPCR. The expressions of JAK2 in various cell lines was detected by western-Blot.? The targeting relationship between miR-197 and JAK2 was verified by bioinformatics prediction and double luciferase reporter gene experiment. Effect of miR-197 on proliferation of A431 was detected by MTS. Effect of MiR-197 on the invasive ability of skin squamous cell carcinoma cells was detected by Transwell. Effect of miR-197 on the expression of N-cadherin， a molecule related to epithelial-mesenchymal transition （EMT） was detected by IFA. Results? The expressions level of miR-197 in skin squamous cell carcinoma tissue and skin squamous cell carcinoma cell line A431 were higher than that in adjacent tissue and human normal skin cell line HaCaT respectively， the differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with A431 and A431-miR-197-siRNA-NC， the expression levels of miR-197 and JAK2 in the stably down-regulated cell line A431-miR-197-siRNA decreased significantly （P<0.05）. Analysis of Target Scan database showed that miR-197 and JAK2 had complementary binding sites. Downregulation of miR-197 could significantly reduce the proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells， and inhibit the expression level of N-cadherin. Conclusion? Downregulation of miR-197 could inhibit the expression of JAK2 and reduce the expression of EMT related molecule N-cadherin in skin squamous cell carcinoma， thus inhibiting the EMT process and proliferation and invasion ability of skin squamous cell carcinoma cells.

Key words： miR-197; human skin squamous cell carcinoma; paracancerous tissue; HaCaT; JAK2; proliferation; invasion; epithelial-mesenchymal transition（EMT）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（Squamous cell cancer，SCC）作為皮膚惡性腫瘤，好發(fā)部位為顏面、耳部、下唇和手背等曝光部皮膚，亦見于口腔黏膜、唇部、舌部及外陰等部位，成為整形外科常見疾病，該病起源于表皮和皮膚附屬器角質(zhì)形成細(xì)胞，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚無有效的治療措施[1-2]，因此深入研究SCC發(fā)生的分子機(jī)制，尋求可靠的靶向目標(biāo)，已成為目前SCC基因治療的熱點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一種具有調(diào)控功能的單鏈小分子，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等密切相關(guān)[3]。有報(bào)道稱[4-5]miRNA-197直接參與器質(zhì)性腫瘤如胃癌、肝癌的形成過程，但未有關(guān)于miRNA-197對(duì)SCC相關(guān)作用機(jī)制的報(bào)道。因此本研究通過對(duì)臨床和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來探討miR-197對(duì)SCC細(xì)胞增殖的影響，以期為SCC的診斷和治療提供新的線索和靶向位點(diǎn)。

1? 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本：收集2018年7月-2019年5月于筆者醫(yī)院接受手術(shù)治療的40例SCC患者癌組織及其距離癌組織超過2.5cm處的正常組織，術(shù)前均未接受化療或者放療等治療措施。所有患者均同意本研究并簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)展開。

1.2 細(xì)胞及主要試劑和儀器：人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431及人正常皮膚細(xì)胞系HaCaT（中國中科院細(xì)胞庫），下調(diào)miR-197的慢病毒載體siRNA及siRNA-NC（陰性對(duì)照）（上海吉瑪有限公司）。

FBS、RPMI1640培養(yǎng)基（TOYOBO）;Trizol 試劑盒（TaKaRa），MTS細(xì)胞增殖試劑盒、western blot試劑盒、Transwell試劑盒（美國BD公司）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國sigma公司）全蛋白抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），Lipofectamine-3 000轉(zhuǎn)染試劑、熒光素酶試劑盒（美國vector公司）;PBS緩沖液（美Amresco公司），青霉素（penicillin， peillin G，100u/ml），鏈霉素（streptomycin，STC，100μg/ml）（華北制藥廠）。Anti-JAK2抗體[4A6]（小鼠單克隆抗體[4A6] to JAK2，ab82539），山羊抗小鼠IgG H&L （HRP）（ab205719），Anti-N Cadherin抗體（兔多克隆抗體to N Cadherin，ab76057），山羊抗兔IgG H&L （Alexa Fluor? 647）預(yù)吸附二抗（山羊多克隆抗體二抗to兔IgG-H&L （Alexa Fluor? 647）預(yù)吸附二抗，ab150083）均購自Abcam。

蘇凈Airtech超凈工作臺(tái)（北京六一儀器廠），SANYO MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國強(qiáng)生公司）;Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡、電鏡（日本三菱公司）;Roche R480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Promega公司），Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Corning公司）。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中miR-197的表達(dá)：依據(jù)Trizol法提取皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織、人正常皮膚細(xì)胞系HaCaT、人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC樣本的總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照PrimeScrip反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒要求執(zhí)行。采用SYBR Premix Ex Taq說明書配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：①預(yù)變性：75℃，120s;②變性：90℃，5min;③退火：60℃，60s;④延伸72℃，30s;⑤PCR儀采集熒光信號(hào)40個(gè)循環(huán)，U6作為內(nèi)參（上游引物為5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，下游引物為5AACGCTTCACGAATTTGCGT-3），miR-197（上游引物為5-ACTGTCTCCCAACCCTTGTA-3，下游引物為5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3），相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT表示。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞中JAK2的表達(dá)：分別收集HaCaT、A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC細(xì)胞，用總蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞中總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。制備蛋白樣品并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含有5% BSA的封閉液室溫下封閉2h。分別加適量用封閉液稀釋的JAK2一抗，之后置于4℃冰箱過夜。次日用PBST將膜沖洗干凈，再分別加稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育2h，PBST洗膜，加ECL避光作用5min，暗室曝光拍照，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-197和JAK2的關(guān)系：采用miR靶基因數(shù)據(jù)庫Target Scan預(yù)測(cè)MiR-197和JAK2的結(jié)合片段。采用PCR擴(kuò)增含有miR-197、JAK2結(jié)合位點(diǎn)的JAK2片段，并將該擴(kuò)增片段插入熒光素酶載體psi-CHECK中，構(gòu)建野生型質(zhì)粒并記為psi-CHECK-JAK2-wild，同時(shí)采用基因突變技術(shù)對(duì)結(jié)合片段中的核苷酸進(jìn)行突變，并構(gòu)建突變型質(zhì)粒psi-CHECK-JAK2-mutant。將miR-197及陰性對(duì)照分別與野生型質(zhì)粒psi-CHECK-JAK2-wild和突變型質(zhì)粒psi-CHECK-JAK2-mutant共轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h，根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶活性值即為報(bào)告基因活性。

1.6 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：調(diào)整細(xì)胞濃度，以5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，輕輕混勻后，置入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，于轉(zhuǎn)染成功2d、3d、4d、5d后分別加MTS試劑20μl，37℃避光4h后，棄掉孔內(nèi)液體，再加DMSO 100μl，置于37℃搖床上快速振蕩15min，以便充分溶解結(jié)晶物，最后將96孔板置于酶標(biāo)儀上檢測(cè) 490nm處的OD值。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲：將40μl matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室中，37℃靜置1h凝固后備用，實(shí)驗(yàn)前12h棄原細(xì)胞培養(yǎng)液并換成無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞消化并用1×PBS清洗，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取5×105細(xì)胞重懸，取200～250μl細(xì)胞懸液至Transwell小室中，下室加入500μl完全培養(yǎng)基，保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡。置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，4%多聚甲醛固定，PBS洗干凈，加0.1%結(jié)晶紫染液室溫避光染色15min，PBS漂洗后用棉棒擦Transwell小室內(nèi)部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。

1.8 IFA檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)分子N-cadherin：將A431、A431-miR-197-siRNA和A431-miR-197-siRNA-NC細(xì)胞消化后鋪至6孔板中，正常培養(yǎng)24h后棄培養(yǎng)基，加4%多聚甲醛固定10min，PBS沖洗后加0.1% Triton100通透15min，PBS沖洗，5% BSA的封閉液室溫封閉30min，分別加適量用封閉液稀釋的N-cadherin一抗，室溫孵育2h，PBS沖洗干凈，加稀釋好的熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗于37℃避光作用1h，用稀釋好的DAPI染細(xì)胞核，封片并置于共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19.0軟件，作圖工具采用Graphpad 5.01，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 miR-197在組織和細(xì)胞中的表達(dá)：RT-qPCR結(jié)果顯示，皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-197的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431中miR-197的表達(dá)水平明顯高于人正常皮膚細(xì)胞系HaCaT，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;穩(wěn)定下調(diào)A431-miR-197-siRNA細(xì)胞系中miR-197的表達(dá)水平顯著低于A431和A431-miR-197-siRNA-NC，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示成功構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)miR-197的皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（見圖1）。

2.2 miR-197對(duì)JAK2表達(dá)的影響：Western-blot結(jié)果顯示，A431-miR-197-siRNA組中JAK2表達(dá)水平明顯下降，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），后兩者之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示miR-197可正向調(diào)控JAK2的表達(dá)（見圖2）。

2.3 miR-197和JAK2關(guān)系預(yù)測(cè)及驗(yàn)證：經(jīng)www.microRNA.org網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-197和JAK2之間有互補(bǔ)結(jié)合序列，提示兩者具有靶向調(diào)控關(guān)系。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，miR-197能顯著抑制野生型psi-CHECK-JAK2-wild的熒光素酶活性（P<0.05），而對(duì)突變型psi-CHECK-JAK2-mutant的熒光素酶活性無影響（P>0.05），提示MiR-197能特異性結(jié)合JAK2。見圖3。

2.4 miR-197對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響：MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，A431-miR-197-siRNA組細(xì)胞在3d、4d和5d時(shí)增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。提示下調(diào)miR-197的表達(dá)，可明顯抑制A431的細(xì)胞的增殖能力，見圖4。

2.5 miR-197對(duì)A431細(xì)胞侵襲能力的影響：Transwell小室結(jié)果顯示，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，A431-miR-197-siRNA組細(xì)胞通過matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示下調(diào)miR-197的表達(dá)后，細(xì)胞侵襲能力明顯減弱，見圖5。

2.6 miR-197對(duì)EMT相關(guān)分子N-cadherin的影響：共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與A431和A431-miR-197-siRNA-NC相比，A431-miR-197-siRNA組細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

3? 討論

SCC在非黑色素皮膚腫瘤中的發(fā)病率僅次于基底細(xì)胞癌，約占20%，好發(fā)于頭面部[6]，研究報(bào)道[7]稱吸煙、免疫抑制劑、化學(xué)致癌物質(zhì)均為其發(fā)病的高危因素，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此目前缺乏根治性的治療手段。已有研究證實(shí)[8]細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子調(diào)控或者參與SCC細(xì)胞的發(fā)生及癌細(xì)胞的增殖，因此從分子基礎(chǔ)生物學(xué)角度出發(fā)尋找SCC靶向標(biāo)志物，為患者提供有效的治療方法有著重要的意義。

miRNA近年來被證實(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、凋亡、腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移以及新血管生成等均發(fā)揮調(diào)控作用[9]。miR-197位于染色體lp13.3，Schulte等研究報(bào)道m(xù)iR-197在子宮內(nèi)膜癌中異常高表達(dá)[10]，Nan等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-197在肺腺癌中促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲。目前尚無明確的報(bào)道研究miR-197的表達(dá)與SCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-197在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中呈高表達(dá)，提示其在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。此外，本研究成功構(gòu)建了miR-197穩(wěn)定下調(diào)細(xì)胞系，以進(jìn)一步證實(shí)miR-197對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制，結(jié)果顯示與A431和A431-miR-197-siRNA-NC組相比，下調(diào)miR-197的表達(dá)后，A431-miR-197-siRNA組細(xì)胞在3d、4d和5d時(shí)增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明過下調(diào)miR-197的表達(dá)，可明顯抑制A431的細(xì)胞的能力，經(jīng)Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-197的A431細(xì)胞穿過matrigel基質(zhì)膠的數(shù)量顯著減少，表明下調(diào)miR-197使腫瘤細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。

[9]Abdelaziz AS.MiRNA directed cancer therapies： Implications in melanoma intervention[J].J Pharmacol Exp Ther，2018，364（1）：1-12.

[10]Kang X，Cao S，Ji Z，et al.miR-3646 promotes vascular inflammation and augments vascular smooth muscle cell proliferation and migration in progression of coronary artery disease by directly targeting RHOH[J].Int J Clin Exp Pathol，2018，11（12）：5830-5839.

[11]Nan Z，Liang T，Miao Z，et al.MicroRNA-197 induces epithelial–mesenchymal transition and invasion through the downregulation of HIPK2 in lung adenocarcinoma[J].J Genet，2018，97（1）：1-7.

[12]Mimura K，Teh JL，Okayama H，et al.PD-L1 expression is mainly regulated by IFN-γ associated with JAK-STAT pathway in gastric cancer[J].Cancer Sci，2018，109（1）：387.

[13]管玲男，劉哲，王歡，等.JAK/STAT3信號(hào)通路及其抑制劑在腫瘤治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志，2018，53（23）：1973-1977.

[14]Chae YK，Chang S，Ko T，et al.Epithelial-mesenchymal transition （EMT） signature is inversely associated with T-cell infiltration in non-small cell lung cancer （NSCLC）[J].Sci Rep，2018，8（1）：2918.

[15]Li W，Liu J，Zou D，et al.Exploration of bladder cancer molecular mechanisms based on miRNA-mRNA regulatory network[J].Oncol Rep，2017，37（3）：1461-1468.

[收稿日期]2019-08-09

本文引用格式：趙思純.MiR-197靶向JAK2調(diào)節(jié)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖侵襲能力的研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（2）：74-78.