不同分離方法及培養(yǎng)條件對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響

徐斌　劉毅

[摘要]目的：觀察不同分離方法及培養(yǎng)條件對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）生物活性的影響。方法：分別用組織塊貼壁法、酶消化法獲取hUCMSCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)，記錄各組首次傳代時(shí)間，相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，流式細(xì)胞儀鑒定其CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR抗原表達(dá)。分別用DMEM-LG、DMEM-HG和DMEM-F12 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)第3代、第7代細(xì)胞，MTT法比較不同時(shí)間點(diǎn)3種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況。結(jié)果：兩種分離方法均能得到較均一的梭形或者多角形貼壁細(xì)胞，胞核大胞漿豐富，CD29、CD44、HLA-ABC抗原表達(dá)陽性，CD34、CD45、HLA-DR抗原表達(dá)陰性。用DMEM-F12培養(yǎng)的細(xì)胞活力更好，細(xì)胞生長更迅速。結(jié)論：兩種分離方法均能得到hUCMSCs，DMEM-F12培養(yǎng)基更能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，較適合于培養(yǎng)hUCMSCs。

[關(guān)鍵詞]組織塊貼壁法;酶消化法;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞;培養(yǎng)基;生物活性

[中圖分類號]Q813.1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）02-0071-03

Abstract： Objective? To observe the effects of different separation methods and culture conditions on biological characteristics of hUCMSCs. Methods? The hUCMSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and digested with collagenase， the time of passage was recorded， in addition， the cell morphology was observed by phase contrast microscope， and the CD29、CD44、HLA-ABC、CD34、CD45、HLA-DR antigen expression was identified using flow cytometry. The 3rd and the 7th generation cells were cultured with DMEM-LG， MEM-HG， and DMEM-F12 culture medium. MTT was used to evaluate the growth of hUCMSCs. Phase contrast microscope was used to observe the morphological changes of aging cells. Results? hUCMSCs could be separated by each method. The adherent cells showed shuttle or multiple angle shapes， with rich cytoplasm， and positive for CD29、CD44、 HLA-ABC antigen， negative for CD34、CD45 and HLA-DR. DMEM-F12 could promote the proliferation of quiescent cells. And the cells presented the better viability. Conclusion? Both of the two methods can produce hUCMSCs， DMEM-F12 medium is more suitable for the culture of hUCMSCs.

Key words： tissue adherence method; collagenase digestion method; human umbilical cord-mesenchymal stem cells（hUCMSCs）; culture medium; biological characteristics

目前較常用的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分離方法有組織塊貼壁法、酶消化法、流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法等，由于流式細(xì)胞儀法和免疫磁珠法對操作技術(shù)要求高，難免對細(xì)胞造成化學(xué)或機(jī)械損傷，影響細(xì)胞生物學(xué)特性，所以很少應(yīng)用。最常用者為前兩種方法。不同的培養(yǎng)基對細(xì)胞的生長情況也有影響，目前常用的培養(yǎng)基有DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12等。本實(shí)驗(yàn)將通過對照觀察兩種不同分離培養(yǎng)方法和三種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的hUCMSCs的生物學(xué)活性，以期找到較適宜的hUCMSCs的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件。

1? 材料和方法

1.1 材料：健康產(chǎn)婦新鮮臍帶（解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第940醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，產(chǎn)婦及家屬授權(quán)同意），DMEM-HG培養(yǎng)基、DMEM-LG培養(yǎng)基、DMEM-F12培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國），胎牛血清（GIBCO公司，美國），膠原酶Ⅳ、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）、MTT（Amresco公司，美國）、DMSO（Amresco公司，美國）

1.2 方法

1.2.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

1.2.1.1 組織塊貼壁法：取新生兒臍帶置無菌生理鹽水，PBS充分洗滌至無血跡， 將其剪碎至碎泥狀后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，加入含10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。7d后，剔除組織塊首次換液。以后每2d換液1次，至貼壁細(xì)胞80%融合后傳代。

1.2.1.2 膠原酶消化法：開始同組織塊貼壁法，臍帶剪碎至碎泥狀轉(zhuǎn)移至1g/L膠原酶Ⅱ中，37℃恒溫振蕩儀持續(xù)消化30min后，隨即用1g/L胰酶37℃恒溫振蕩儀持續(xù)消化30min。以細(xì)胞篩過濾消化液，濾液1 500r/min離心10min，棄上清液以PBS洗2次。按照1.0×106/cm2的密度均勻接種于含DMEM-F12培養(yǎng)液（含10% FBS）的培養(yǎng)皿中。3d后首次換液，去掉未貼壁細(xì)胞。以后每2d換液1次，至貼壁細(xì)胞80%融合后傳代。

1.2.2 細(xì)胞消化傳代：棄去培養(yǎng)基，10% PBS沖洗3遍，加入胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化后可見細(xì)胞收縮變圓，即將脫離皿壁時(shí)棄消化酶，加2倍體積10% PBS終止消化，反復(fù)吹打混勻，1 000r/min離心10min棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，以1：3～1：4比例細(xì)胞傳代，記P1，傳至P3代后， 細(xì)胞形態(tài)較為單一穩(wěn)定。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的活力和生長情況，并適時(shí)照相。

1.2.3 流式細(xì)胞儀鑒定：取P3、P5、P7代hUCMSCs，棄培養(yǎng)基，1：1的2.5g/L胰蛋白酶（2.5g/L）和EDTA（0.2g/L）混合液（1：1）消化，以10% PBS洗滌3遍，制成濃度為3×105的單細(xì)胞懸液，每個(gè)Eppendof管加100μl細(xì)胞懸液，共6管。分別加入抗人CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD45-PerCP、HLA-DR-FITC，HLA-ABC-FITC各10μl，室溫孵育30min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4 不同培養(yǎng)基對細(xì)胞的影響：以MTT法和計(jì)數(shù)板法檢測不同培養(yǎng)基對細(xì)胞增殖情況的影響：取第3代形態(tài)均一的細(xì)胞分別以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12配置成密度為1×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔0.2ml向96孔板接種，細(xì)胞處理組每板接種30個(gè)孔，2d換液，前9d每日每組取3個(gè)孔加入20μl MTT常溫孵育5h，棄去培養(yǎng)基加100μl二甲基亞砜常溫振蕩10min，酶標(biāo)儀檢測吸光度值（492nm波長）;部分細(xì)胞分別以3×104/孔接種到24孔板中，每天各取3孔消化計(jì)數(shù)細(xì)胞。連續(xù)觀察9d，以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸繪制生長曲線。

1.2.5 觀察指標(biāo)：MTT法和計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法比較不同時(shí)間點(diǎn)3種培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以（x?±s）表示計(jì)量資料，運(yùn)用單因素方差分析進(jìn)行3組間比較，P<0.05為差異有顯著性意義。

2? 結(jié)果

2.1 不同分離方法的影響：用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)hUCMSCs，7d左右可見散在的長條狀細(xì)胞（見圖1A）。棄組織塊，更換培養(yǎng)液，可見多個(gè)貼壁生長細(xì)胞集落。每個(gè)集落細(xì)胞數(shù)數(shù)量不等，形態(tài)與骨髓間充質(zhì)極為相似，大為多角形或扁平狀的成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞透光度好，核仁明顯，胞體與骨髓MSC無明顯差異。1周后，每個(gè)細(xì)胞集落細(xì)胞數(shù)可達(dá)數(shù)百個(gè)，細(xì)胞形態(tài)大多漸變均一的紡錘形。2周左右90%細(xì)胞發(fā)生融合。此時(shí)以胰酶消化，按1：3的比例傳代，傳代后的細(xì)胞增殖迅猛，約每2d即可達(dá)到90%以上融合，需多次傳代或凍存。

用膠原酶消化法分離hUCMSC，第2天即看見有散在的條索狀貼壁細(xì)胞（見圖1B）。1周左右時(shí)，成纖維樣細(xì)胞貼壁并形成集落，偶見少量異常細(xì)胞集落，呈卵石樣，或?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞集落。成纖維樣細(xì)胞增殖能力強(qiáng)大，至2周左右可達(dá)到90%細(xì)胞發(fā)生融合。多次傳代后可得到形態(tài)均一穩(wěn)定的成纖維樣細(xì)胞（見圖2）。傳代后的細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，性質(zhì)穩(wěn)定，但多次傳代后細(xì)胞漸老化。

鏡下觀察發(fā)現(xiàn)傳代培養(yǎng)2～3d后細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)增長期。兩組細(xì)胞均生長旺盛，首次傳代時(shí)間平均為3～5d，傳代時(shí)間比較差異無顯著性意義（F=31.5，P>0.05）。兩種方法分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過傳代后均生長較好，兩組細(xì)胞生長活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 細(xì)胞鑒定：用倒置相差顯微鏡可以觀察到較均一的長梭形或扁平形的成纖維樣細(xì)胞，折光度好，核仁明顯。隨著細(xì)胞迅速擴(kuò)增，細(xì)胞集落呈現(xiàn)出典型的漩渦狀（見圖2）。經(jīng)過2傳代，均可得到形態(tài)均一的細(xì)胞。流式鑒定其陽性表達(dá)CD29、CD44、HLA-ABC，陰性表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR，證明是hUCMSCs。

2.3 不同培養(yǎng)基對生長的影響：分別以DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM-F12 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)第3代的hUCMSCs后，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)較DMEM-LG和DMEM-HG而言，DMEM-F12組的A492nm明顯較高（見表1）。計(jì)數(shù)板法觀察到DMEM-F12組細(xì)胞提前發(fā)生倍增，細(xì)胞總量也最多（見圖3）。

3? 討論

2000年，Rrices[1]首次報(bào)道從臍帶血中可以分離培養(yǎng)出一種能夠分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的多能干細(xì)胞，后來證實(shí)為hUCMSCs，隨后Mitchell等[2]研究發(fā)現(xiàn)，臍帶華爾通氏膠的基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)能增殖80倍以上，能表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)記包括c2kit（CD117）和端粒酶。提示可能有間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）存在于臍帶中，隨后有多位學(xué)者分別從臍靜脈內(nèi)皮和內(nèi)皮下、臍帶Whartons膠質(zhì)和血管周圍組織中分離培養(yǎng)出了hUCMSCs，并初步建立了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法[3-5]。

各個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用多種方法進(jìn)行hUCMSCs的分離培養(yǎng)，許多研究人員嘗試通過改變培養(yǎng)條件和改變培養(yǎng)基成分對間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增進(jìn)行探索[6]，目前用于hUCMSCs的組織培養(yǎng)主要是臍帶華通膠和臍靜脈[7-8]，獲取方法主要有酶消化法[9]、組織塊法等。盡管組織塊法獲取細(xì)胞耗時(shí)過長，但這種方法獲得的細(xì)胞純度更高、且增殖率較高[10]。而且酶消化法耗材昂貴、操作技術(shù)要求高，耗時(shí)較長，難免對細(xì)胞造成化學(xué)和機(jī)械損傷。Iftimia-Mander等[11]研究亦表明酶消化臍帶分離出的MSCs，其細(xì)胞活性較組織塊法低。與此相比，組織塊法則簡捷，經(jīng)濟(jì)，能夠更好地維持細(xì)胞活力并減少損傷機(jī)會(huì)，培養(yǎng)體系中避免了血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或其他細(xì)胞的干擾。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊貼壁法與酶消化法分別成功獲得貼壁生長的hUCMSCs并形成集落和傳代擴(kuò)增，且傳代后的細(xì)胞在數(shù)量與生長活性方面無明顯差異。

Romanov等[9]認(rèn)為胎兒血液循環(huán)中富含hUCMSCs，并且隨著胎兒的成熟，大部分hUCMSCs定位于臍靜脈內(nèi)皮下層和胎盤。這就部分解釋了臍帶富含MSCs的原因。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，選擇培養(yǎng)足月產(chǎn)胎兒臍帶所hUCMSCs較多，這與Romanov的觀點(diǎn)相符合;在臍帶分離培養(yǎng)過程中注意無菌操作，在分離華通膠時(shí)剔除動(dòng)靜脈血管以免內(nèi)皮細(xì)胞混入;分離出的華通膠不必再經(jīng)過消毒劑浸泡，因?yàn)榭赡軙?huì)對hUCMSCs活性有影響。

hUCMSCs相對于其他細(xì)胞更脆弱，對環(huán)境敏感性更強(qiáng)，生長環(huán)境微弱的變化或許就會(huì)影響它的生長，因此必須選擇適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)有DMEM-LG，DMEM-HG，DMEM-F12 3種。文獻(xiàn)報(bào)道中常用DMEM-LG，但是細(xì)胞的首次傳代時(shí)間長，需要14d左右[12]，傳代細(xì)胞的生長周期也較長。但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DMEM-F12培養(yǎng)的hUCMSCs生長旺盛，細(xì)胞形態(tài)均一穩(wěn)定，原代培養(yǎng)時(shí)間短（約10d），并且能保持hUCMSCs長期處于未分化狀態(tài)，這也許是因?yàn)榕c前兩者相比DMEM-F12含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素。

總之，應(yīng)用組織塊貼壁法與酶消化法都能夠得到純度較高的hUCMSCs，且不影響其生物學(xué)活性，但組織塊貼壁法操作更為簡捷、效率更高，是適宜的hUCMSCs分離方法。同時(shí)，DMEM-F12培養(yǎng)基可能較DMEM-LG、DMEM-HG培養(yǎng)基更適合于hUCMSCs的培養(yǎng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Rices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymal progenitic or cells in human umbilical cord blood[J].Br J Haematol，2000，109（1）：2352242.

[2]Mitchell KE，Weiss ML，Mitchell BM，et al.Matrix cells from Whartons jelly from neurons and glia[J].Stem Cells，2003，21（1）：50-60.

[3]Jomura S，Uy M，Mitchell K，et al.Potential treatment of cerebral global ischemia with Oct-4+ umbilical cord matrix cells[J].Stem Cells，2007，25（1）：98-106.

[4]Weiss ML，Medicetty S，Bledsoe AR，et al.Human umbilical cord matrix stem cells： preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinsons disease[J].Stem Cells，2006，24（3）：781-792.

[5]Wang HS，Hung SC，Peng ST，et al.Mesenchymal stem cells in the Whartons jelly of the human umbilical cord[J].Stem Cells，2004，22（7）：1330-1337.

[6]Hartmann I，Hollweck T，Haffner S，et al.Umbilical cord tissue-derived messenchymal stem cells grow best under GMP-compliant culture conditions and maintain their phenotypic and functional?properties[J].J Immunol Methods，2010，363（1）：80-89.

[7]Troyer DL，Weiss ML.Whartons jelly-derived cells are a primitive stromal cell population[J].Stem Cells，2008，26（3）：591-599.

[8]Kestendjieva S，Kyurkchiev D，Tsvetkova G，et al.Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord[J].Cell Biol Int，2008，32（7）：724-732.

[9]Romanov YA，Svintaitakaya VA，Smirnov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells： andidate MSC-like cells from umbilical cord[J].Stem Cells，2003，21（1）：105-110.

[10]Salehinejad P，Alitheen NB，Ali AM，et al.Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Whartons jelly [J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2012，48（2）：75-83.

[11]Iftimia-Mander A，Hourd P，Dainty R，et al.Mesenchymal stem cell isolation from human umbilical cord tissue： understanding and minimizing variability in cell yield? for process optimization[J].Biopreserv? Biobank，2013，11（5）：291-298.

[12]劉毅，肖宏濤.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與蠶絲素多孔支架的體外復(fù)合培養(yǎng)[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2010，16（1）：45-48.

[收稿日期]2019-07-18

本文引用格式：徐斌，劉毅.不同分離方法及培養(yǎng)條件對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物活性的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（2）：71-74.