擬南芥SSCD1基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素積累的影響

曾祥如，雷雨婷，姜依何，任春梅,2*

擬南芥基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素積累的影響

曾祥如1，雷雨婷1，姜依何1，任春梅1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

為探索花青素生物合成的調(diào)控機(jī)制，以模式植物擬南芥野生型Col–0和酪氨酸降解途徑缺陷突變體為試驗(yàn)材料，分析5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)外源苯丙氨酸處理后花青素的積累和花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，探討酪氨酸降解途徑受阻是否影響苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：外源添加不同濃度苯丙氨酸能提高擬南芥幼苗花青素的含量，而且花青素的含量隨著苯丙氨酸濃度的增加而增多；苯丙氨酸處理后，突變體幼苗中花青素的積累增多，同時(shí)花青素生物合成基因，如、、、、、的表達(dá)水平在突變體中都顯著上調(diào)，表明基因突變會(huì)阻斷酸酪氨酸降解，增加苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的合成。

擬南芥；花青素；苯丙氨酸；基因；突變體；酪氨酸降解途徑

花青素是植物中常見(jiàn)的一種天然色素，主要存在于植物器官的表皮細(xì)胞，在植物抗逆、防御病蟲(chóng)害、育花、育種以及維持植物內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定等方面都發(fā)揮著重要作用[1–2]?；ㄇ嗨亟?jīng)兩部分合成：第一部分是花青素生物合成上游，花青素合成底物苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(CHI)等多種酶的作用下形成中間代謝物二氫黃酮醇；第二部分是花青素生物合成下游，二氫黃酮醇在二氫黃酮醇還原酶(DFR)、花青素合成酶(LDOX)、黃酮3,5–糖苷轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等多種酶的催化下形成穩(wěn)定的花色素[3–4]。

酪氨酸降解途徑是動(dòng)物必需的代謝途徑，苯丙氨酸可以在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為酪氨酸進(jìn)行降解[5]。HAN等[6]發(fā)現(xiàn)，植物中酪氨酸降解也具有生物功能，編碼擬南芥酪氨酸降解途徑的基因突變能導(dǎo)致短日照下細(xì)胞死亡。湯睿等[7]的研究結(jié)果表明，在長(zhǎng)日照下酪氨酸也可以進(jìn)行降解。然而，植物中苯丙氨酸是否轉(zhuǎn)化為酪氨酸進(jìn)行降解尚不清楚。苯丙氨酸是花青素的合成前體，如果苯丙氨酸在植物中可轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行降解，那么，由于阻斷了酪氨酸降解，基因突變會(huì)減少苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸，從而增加苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的積累。本研究中，以突變體為試驗(yàn)材料，野生型Col–0為對(duì)照，通過(guò)苯丙氨酸處理，采用植物生理學(xué)方法檢測(cè)花青素含量，并以分子生物學(xué)方法檢測(cè)花青素生物合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，探究酪氨酸降解途徑受阻是否影響苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的合成。

1　材料與方法

1.1　材料

擬南芥()野生型Columbia (Col–0)和突變體種子均由作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物信號(hào)傳導(dǎo)課題組提供。

1.2　主要試劑與儀器

苯丙氨酸；種子消毒液(20% Bleach + 0.1% Triton X–100)；花青素提取液(18% 正丙醇，1% HCl，81% ddH2O)；Bio–RAD CFX connectTMoptics Module型熒光定量PCR儀；UV–1700型紫外分光光度計(jì)；人工氣候箱PRX–450B。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1擬南芥幼苗的培養(yǎng)

將擬南芥Col–0及突變體種子在消毒液中浸泡10 min，用超純水清洗4～5遍后，鋪種于含1% 蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃下春化處理3 d，置于人工氣候箱(16 h光照/8 h黑暗)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度(22 ± 2) ℃，光照度80～120 lx，相對(duì)濕度65%。

1.3.2花青素相對(duì)含量的測(cè)定

將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的Col–0及小苗分別轉(zhuǎn)移至含5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L)苯丙氨酸的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)7 d。根據(jù)DEIKMAN等[8]的方法測(cè)定擬南芥幼苗中花青素的含量。隨機(jī)選取苯丙氨酸處理后的材料，每個(gè)處理6個(gè)樣品，每個(gè)樣品取10株幼苗。吸干樣品上的水分，測(cè)得材料鮮質(zhì)量，置于裝有1 mL花青素提取液的EP管中。沸水浴3 min后，室溫下黑暗過(guò)夜。用UV-–1700型紫外分光光度計(jì)測(cè)定處理樣品在535 nm和650 nm的吸收值，花青素相對(duì)含量為每克植物材料在535nm和650nm吸光值的差值。3次重復(fù)。試驗(yàn)誤差用SE表示。

1.3.3RNA提取與qRT–PCR分析

將在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的Col–0及小苗轉(zhuǎn)移至含2 mmol/L苯丙氨酸的MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)7 d，隨機(jī)分別摘取Col–0及幼苗的新鮮葉片100 mg，通過(guò)Trizol法提取材料總RNA。采用羅氏SYBR qPCR Mix 熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT–PCR分析。具體操作按湯睿等[9]的方法進(jìn)行，以?xún)刹椒ǔ绦蛟跓晒舛縋CR儀(Bio–RAD CFX connectTMoptics Module)上完成。qRT–PCR內(nèi)參基因?yàn)椋镄蛄幸?jiàn)表1。

表1　qRT–PCR引物序列

1.4　數(shù)據(jù)分析

采用2–ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　SSCD1基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素積累的影響

為探究基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)擬南芥幼苗花青素積累的影響，用5種濃度(0、0.1、0.5、1.0、2.0mmol/L)苯丙氨酸分別處理擬南芥野生型(Col–0)和突變體幼苗，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)苯丙氨酸濃度為0、0.5 mmol/L時(shí)，突變體與野生型幼苗顏色無(wú)明顯差別；用1.0 mmol/L苯丙氨酸處理后，植株莖稈和葉片背面開(kāi)始出現(xiàn)淡紫色花青素的積累，突變體葉片的顏色略深于野生型的；苯丙氨酸濃度增至2.0 mmol/L時(shí)，突變體幼苗背面和莖稈的紫色面積擴(kuò)大，呈深紫色，顏色明顯深于野生型的。

為更明確地了解苯丙氨酸處理后擬南芥野生型和突變體的花青素積累，對(duì)其花青素相對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)苯丙氨酸濃度為0、0.1 mmol/L時(shí)，突變體中花青素的相對(duì)含量較低，與野生型的無(wú)明顯差異；當(dāng)苯丙氨酸濃度為0.5 mmol/L時(shí)，突變體中花青素相對(duì)含量相比野生型的稍有上升；當(dāng)苯丙氨酸濃度為1.0 mmol/L時(shí)，突變體中花青素相對(duì)含量顯著高于野生型的(<0.05)；當(dāng)苯丙氨酸濃度為2.0 mmol/L時(shí)，二者具有極顯著差異(<0.01)。以上結(jié)果表明，基因突變能促進(jìn)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的積累。

a、b、c、d分別為苯丙氨酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時(shí)擬南芥野生型Col–0的表型；e、f、g、h分別為苯丙氨酸濃度為0、0.5、1.0、2.0 mmol/L時(shí)擬南芥突變體sscd1的表型。

“*”表示在0.05水平下差異顯著；“**”表示在0.01水平下差異極顯著。

2.2　SSCD1基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素生物合成上游基因表達(dá)的影響

采用qRT–PCR對(duì)花青素生物合成上游基因和的表達(dá)進(jìn)行分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)未添加苯丙氨酸時(shí)，擬南芥突變體中這些基因的表達(dá)量較低，與野生型無(wú)明顯差異；經(jīng)苯丙氨酸處理后，突變體和野生型(Col–0)幼苗中3個(gè)基因的表達(dá)量均顯著增加，且在突變體中的表達(dá)量顯著高于野生型的(< 0.05)，說(shuō)明苯丙氨酸能誘導(dǎo)花青素生物合成上游基因的表達(dá)，基因突變能上調(diào)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素生物合成上游基因的表達(dá)。

CK為未經(jīng)苯丙氨酸處理的對(duì)照組；phe為經(jīng)2.0 mmol/L苯丙氨酸處理的試驗(yàn)組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　SSCD1基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素生物合成下游基因表達(dá)的影響

對(duì)花青素生物合成下游基因、、進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，未添加苯丙氨酸時(shí)，擬南芥突變體中、、基因的表達(dá)量相比野生型的無(wú)顯著差別；經(jīng)苯丙氨酸處理后，這些基因的表達(dá)量均顯著增加，在突變體中的表達(dá)量顯著高于野生型對(duì)照的(<0.05)。說(shuō)明苯丙氨酸可誘導(dǎo)花青素生物合成下游基因的表達(dá)，而基因突變會(huì)增強(qiáng)苯丙氨酸的誘導(dǎo)作用。

CK為未經(jīng)苯丙氨酸處理的對(duì)照組；phe為經(jīng)2.0 mmol/L苯丙氨酸處理的試驗(yàn)組。不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

3　結(jié)論與討論

苯丙氨酸參與植物次生代謝途徑，并在一系列酶的作用下合成花青素及黃酮類(lèi)物質(zhì)，對(duì)植物生長(zhǎng)具有重大意義[10]。在新疆紫草中，L–苯丙氨酸可顯著促進(jìn)毛狀根中花青素的積累[11]。本研究中，外源添加不同濃度苯丙氨酸能提高擬南芥幼苗花青素的含量，而且花青素的含量隨著苯丙氨酸濃度的增加而增多。對(duì)花青素合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT–PCR分析，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸處理能上調(diào)花青素生物合成的上游和下游基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了苯丙氨酸能調(diào)控植物中花青素的合成。

ZHOU等[12]的研究結(jié)果表明，酪氨酸處理擬南芥幼苗可誘導(dǎo)花青素的積累，但編碼酪氨酸降解途徑最后一個(gè)酶的基因突變后會(huì)降低酪氨酸誘導(dǎo)花青素的積累。突變會(huì)產(chǎn)生酪氨酸降解途徑的異常代謝產(chǎn)物(琥珀酰丙酮)，體內(nèi)積累較多琥珀酰丙酮會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒害作用[13–14]。外源酪氨酸處理會(huì)加速酪氨酸降解，從而增加琥珀酰丙酮在突變體中的積累，推測(cè)可能是因?yàn)殓牾１亩竞τ绊懥死野彼嵴T導(dǎo)花青素的生物合成。尿黑酸是酪氨酸降解途徑的中間產(chǎn)物[15]，湯睿等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外源尿黑酸處理能誘導(dǎo)花青素的合成，并且在突變體中外源尿黑酸誘導(dǎo)合成的花青素增多，說(shuō)明基因突變阻礙了尿黑酸經(jīng)酪氨酸降解途徑進(jìn)行降解，從而增加了尿黑酸誘導(dǎo)花青素的積累。苯丙氨酸在動(dòng)物中可轉(zhuǎn)化為酪氨酸進(jìn)行降解[16]。雷雨婷等[17]發(fā)現(xiàn)，外源苯丙氨酸處理更明顯地抑制突變體的幼苗生長(zhǎng)，說(shuō)明在植物中苯丙氨酸也有可能轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行降解。苯丙氨酸是花青素的合成底物。本研究中，苯丙氨酸處理后突變體的花青素積累以及花青素生物合成上游和下游基因的表達(dá)都高于野生型，說(shuō)明在野生型擬南芥中外源處理的苯丙氨酸除了用于花青素的合成，還有一部分轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行降解，而在突變體中，由于酪氨酸降解途徑受阻，苯丙氨酸難以通過(guò)轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行降解；因此，苯丙氨酸處理后突變體幼苗合成的花青素要高于野生型的。該研究結(jié)果說(shuō)明基因突變，可阻礙酪氨酸降解，增加苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素的積累，也證明了在植物中苯丙氨酸可以轉(zhuǎn)化成酪氨酸進(jìn)行降解。

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Effects ofmutation on phenylalanine-induced anthocyanin accumulation in

ZENG Xiangru1，LEI Yuting1，JIANG Yihe1，REN Chunmei1,2*

(1.College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China)

In this paper, the model plantwild type Col-0 and tyrosine degradation pathway defective mutantwere used as experimental materials to explore the regulatory mechanism of anthocyanin biosynthesis, to analyze the accumulation of anthocyanin and anthocyanin biosynthesis related gene expression after treatment with exogenous phenylalanine, and to explore whether the blocked tyrosine degradation pathway affect phenylalanine-induced anthocyanin accumulation. The results showed that the accumulation of anthocyanins inmutant seedlings increased after phenylalanine treatment, meanwhile, the expression levels of anthocyanin biosynthetic genes including,,,,andwere significantly upregulated inmutants. This results indicated that blocking tyrosine degradation bygene mutation could increase the synthesis of anthocyanin.

; anthocyanin; phenylalanine;gene;mutant; tyrosine degradation pathway

10.13331/j.cnki.jhau.2020.01.006

Q786

A

1007-1032(2020)01-0033-05

2019–05–23

2019–06–28

國(guó)家“973”計(jì)劃前期研究專(zhuān)項(xiàng)(2014CB160308)

曾祥如(1996—)，女，新疆瑪納斯人，碩士研究生，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，1719809744@qq.com；

，任春梅，博士，教授，主要從事植物分子遺傳學(xué)研究，rencm66@163.com

曾祥如，雷雨婷，姜依何，任春梅．?dāng)M南芥基因突變對(duì)苯丙氨酸誘導(dǎo)花青素積累的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(1)：33–37．

ZENG X R，LEI Y T，JIANG Y H，REN C M. Effects ofmutation on phenylalanine-induced anthocyanin accumulation in[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1): 33–37.

http://xb.hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正