瑤山雞TRH基因編碼區(qū)序列變異及其與繁殖性狀的相關(guān)性

伍革民，朱麗莉，韓 雪，唐繼高

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005)

促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)最早是從豬和綿羊的下丘腦分離出的一種釋放激素，其最經(jīng)典的功能是調(diào)節(jié)垂體促甲狀腺激素的合成和分泌。該激素除分布于下丘腦、小腦、延髓等神經(jīng)組織外，還分布于許多非神經(jīng)組織中，如胰腺、免疫系統(tǒng)、胃腸道、睪丸、前列腺、精囊、附睪、胎盤、子宮、卵巢、皮膚、視網(wǎng)膜等，具有廣泛的生物學(xué)作用，如TRH參與心情與情感的調(diào)節(jié)，可用于抑郁癥的治療；調(diào)節(jié)睪酮的分泌，參與前列腺的局部自分泌，調(diào)控前列腺生長(zhǎng)，可能與男性生育能力有關(guān)[2-3]；與雌激素及垂體血管活性腸肽等一起調(diào)控催產(chǎn)素和催乳素的分泌[4-5]。人TRH基因編碼含242個(gè)氨基酸的TRH激素原前體，TRH基因先被翻譯為激素原前體ppTRH，ppTRH除加工生成經(jīng)典的TRH外，還可衍生出大量其他多肽，這些多肽具有不同的生物學(xué)功能，如ppTRHl78-199(pFE22)可抑制腎上腺皮質(zhì)醇和PRL分泌，ppTRH178-185(pEQ7)和ppTRH186-199(pSEl4)參與釋放催乳素(PRL)[7-8]。在畜禽中，該基因主要與豬、牛的生長(zhǎng)性狀以及斗雞的攻擊行為有關(guān)[9-12]。前期研究表明，瑤山雞TRH基因的受體(thyrotropin-releasing hormone receptor，TRHR)編碼區(qū)變異與雞繁殖性狀沒(méi)有顯著關(guān)聯(lián)[13]，但TRH基因自身的序列變異是否與雞繁殖性狀有關(guān)不明確。為此，檢測(cè)瑤山雞群體TRH基因編碼區(qū)序列變異情況，并與雞繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以明確其作為繁殖性狀輔助選育基因的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

120日齡瑤山雞母雞60只，選自貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場(chǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)管理。轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單只單籠飼養(yǎng)至300日齡，翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 性狀測(cè)定 測(cè)定開產(chǎn)體重、300日齡產(chǎn)蛋量，觀測(cè)開產(chǎn)日齡、首次就巢日齡、首次就巢持續(xù)時(shí)間、首次就巢至重新開產(chǎn)間隔和300日齡就巢次數(shù)等繁殖性狀，測(cè)定方法按照NY/T 823-2004[14]進(jìn)行。

1.2.2 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì) 用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取DNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞TRH基因編碼區(qū)及調(diào)控區(qū)序列(登錄號(hào):NC_006099.3)設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由天根生化科技有限公司合成。

表1 用于瑤山雞TRH基因型檢測(cè)的引物信息Table 1 Primer information for TRH genotype detection of Yaoshan Chicken

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR反應(yīng)體系:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)參數(shù):95℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，根據(jù)設(shè)定退火溫度退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，60個(gè)樣本測(cè)序委托諾賽基因組研究中心有限公司檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，用BLAST分析序列SNPs，用DNAMAN軟件分析SNPs變異情況。TRH基因分型用Excel統(tǒng)計(jì)，用PopGen 32軟件分析群體多樣性，用SPSS 18.0采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRH基因序列變異和群體遺傳多樣性

通過(guò)測(cè)序、分型及與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較，在60只瑤山雞中共檢測(cè)到4個(gè)變異位點(diǎn)，1個(gè)變異位點(diǎn)位于基因2299位置(內(nèi)含子2)，相對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)序列，瑤山雞所有樣本在此處缺失單堿基A；其余3個(gè)位點(diǎn)分別位于基因2458(內(nèi)含子2)、2699(外顯子3)和3857(外顯子3)位置，位于基因2699位置的變異(A→T)導(dǎo)致該蛋白質(zhì)第127位氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(谷氨酰胺Q→亮氨酸L:CAG→CUG)(表2)。

表2 瑤山雞TRH基因的SNP位點(diǎn)Table 2 The SNP loci of TRH gene in Yaoshan Chicken

從表3看出，瑤山雞TRH基因各位點(diǎn)的平均雜合度在0.2061～0.5000，多態(tài)信息含量在0.189 0～0.375 0，遺傳多樣性處于中下水平。經(jīng)哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)，各位點(diǎn)均沒(méi)有偏離平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 瑤山雞TRH基因的遺傳多態(tài)性Table 3 Genetic polymorphisms of Yaoshan Chicken TRH gene

2.2 變異位點(diǎn)基因型與繁殖性狀的相關(guān)性

從表4可知，A2458G位點(diǎn)AA、AG及GG基因型的開產(chǎn)日齡、300日齡產(chǎn)蛋量、就巢性狀間差異均不顯著。A2699T位點(diǎn)AA與AT基因型的開產(chǎn)日齡、300日齡產(chǎn)蛋量、首次就巢日齡、首次就巢持續(xù)時(shí)間、300日齡就巢次數(shù)間差異顯著或極顯著。G3857T位點(diǎn)GG、GT、TT基因型的開產(chǎn)日齡差異不顯著，但300日齡產(chǎn)蛋量、就巢性狀間差異顯著或極顯著。說(shuō)明，A2699T、G3857T的不同位點(diǎn)基因型與繁殖性狀存在顯著或極顯著關(guān)聯(lián)。

表4 TRH基因位點(diǎn)的繁殖性狀Table 4 Correlation between TRH gene loci and reproductive traits

注:同位點(diǎn)不同基因型繁殖性狀列不同大、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。
Note:Different capital and lowercase letters in the same row means significant difference atP<0.01 andP<0.05 levels respectively.

3 結(jié)論與討論

候選基因鑒定法是分析數(shù)量性狀基因的重要方法之一。促甲狀腺激素釋放激素(TRH)具有廣泛的生物學(xué)作用，在睪丸、前列腺、精囊、附睪、胎盤、子宮、卵巢等生殖器官中分布，可促進(jìn)催產(chǎn)素和催乳素的分泌。由此推測(cè)，TRH可能與性腺功能有關(guān)，因此將TRHR基因作為雞繁殖性狀關(guān)聯(lián)的候選基因之一，開展序列變異檢測(cè)并與繁殖性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索該基因SNP變異，到目前為止共檢測(cè)到1 572處SNP變異，這些變異主要分布于人，在雞中還沒(méi)有該基因SNP變異的記錄。TRH基因定位于雞12號(hào)染色體上，序列全長(zhǎng)4 557 bp，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。試驗(yàn)針對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，第一外顯子區(qū)域未能設(shè)計(jì)出合適的引物，設(shè)計(jì)引物P1擴(kuò)增產(chǎn)物包含了完整的外顯子2序列，引物P2和P3擴(kuò)增產(chǎn)物包含了外顯子3的編碼區(qū)域序列和部分非編碼區(qū)域序列。

TRH的經(jīng)典功能是調(diào)節(jié)垂體促甲狀腺激素(TSH)的合成和分泌，在畜禽方面對(duì)該基因的研究主要集中于生長(zhǎng)性狀，如促甲狀腺激素釋放激素基因在文山牛垂體組織中處于下調(diào)狀態(tài)，在西口塔爾牛和云嶺牛垂體組織中處于上調(diào)狀態(tài)，可能與南方黃牛生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)；TRH基因多態(tài)座位ss325994933與金皮豬資源家系個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育后期，尤其是150日齡、180日齡期間增重有顯著關(guān)聯(lián)，其在國(guó)內(nèi)和國(guó)外豬種中的基因頻率亦存在明顯的對(duì)立分布差異[11]；吐魯番斗雞較強(qiáng)的攻擊行為可能與血清中TRH含量偏高有關(guān)，其下丘腦TRH mRNA相對(duì)表達(dá)量高于海蘭蛋雞[10]。研究結(jié)果表明，在瑤山雞群體中，TRH基因篩選到3個(gè)變異位點(diǎn)，其中，A2699T、G3857T變異位點(diǎn)與瑤山雞產(chǎn)蛋和就巢性狀存在顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，說(shuō)明該基因可能參與雞繁殖性狀的調(diào)控，可作為雞的繁殖性狀候選基因開展進(jìn)一步研究和應(yīng)用。TRH發(fā)揮生物功能需通過(guò)與其靶細(xì)胞表面的TRH受體(TRHR)結(jié)合，以激活胞內(nèi)第二信使通路，從而調(diào)控基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)[11]。前期研究表明，TRHR基因多態(tài)變異與雞繁殖性狀不存在關(guān)聯(lián)，TRH基因參與雞的繁殖功能，與其自身變異有關(guān)，與TRHR基因無(wú)關(guān)，其調(diào)控雞繁殖性狀的分子機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。