豬圓環(huán)病毒3型PCR診斷方法的建立及初步應(yīng)用

姜玲玲，徐 雨，余國富，魏賜開，唐遠(yuǎn)江，盧昱希，蒲 齡，楊 莉，余 波*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005; 2.貴州省關(guān)嶺縣畜牧服務(wù)中心，貴州 關(guān)嶺 561000; 3.貴州省清鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 清鎮(zhèn) 551400; 4.貴州省甕安縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 甕安 550400)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，是獸醫(yī)學(xué)上迄今發(fā)現(xiàn)的最小的病毒。根據(jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列將PCV分為PCV1和PCV2兩種血清型，其中PCV1不具有致病性，而PCV2能引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎及其他豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病[2-3]。2016年10月PALINSKI等首次從有類似劇烈豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)癥狀的死亡母豬身上利用宏基因組測序技術(shù)鑒定出一種新的圓環(huán)病毒即豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)以來，1年多的時(shí)間里PCV3已經(jīng)在亞洲、歐洲、美洲的許多國家和地區(qū)被檢測到。KU等對中國11省1直轄市和地區(qū)35個(gè)農(nóng)場的222份樣品進(jìn)行PCV3的PCR檢測，陽性農(nóng)場占比68.6%，表明PCV3已經(jīng)在中國廣泛流行。FU等對中國2015-2017年收集的中國南方部分省份臨床樣品進(jìn)行的檢測結(jié)果顯示，養(yǎng)殖場陽性率從 41.2%上升到60.5%，樣品陽性率從21.9%上升到26.7%，而且存在混合感染情況，PCV3陽性樣品與PCV2的共感染率達(dá)22.3%，增加了該病的防控難度。邢廣源采用常規(guī)PCR檢測方法對不同日齡、不同組織器官進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示PCV3檢出率最好的組織器官為淋巴結(jié)，其次為肺、扁桃體、腎、腦等組織，表明PCV3對動(dòng)物的危害范圍廣。徐國等首次證實(shí)貴州省存在PCV3。2018-2019年對貴州各屠宰場進(jìn)行PCV3核酸檢測，2018年陽性率為14.2%，2019年陽性率為11.6%，表明貴州屠宰場PCV3感染率較高。

PCV3基因組包含2000 bp，具有與PCV1和PCV2相似的基因組結(jié)構(gòu)[9-11]，PCV3病毒可能與PCV相關(guān)性疾病相關(guān)，在臨床上表現(xiàn)為仔豬斷奶后出現(xiàn)多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)和豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)。目前尚未見報(bào)道分離到PCV3活毒株，對其理化性質(zhì)了解較少。PALINSKI R在豬睪丸細(xì)胞和豬腎細(xì)胞(PK-15)進(jìn)行細(xì)胞分離，未觀察到細(xì)胞病變，間接免疫熒光檢測也無明顯熒光?，F(xiàn)對PCV3檢測的主要方法包括宏基因組、常規(guī)PCR、多重定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(mq PCR)、Taq Man實(shí)時(shí)PCR、實(shí)時(shí)重組酶聚合酶擴(kuò)增(rt-RPA)、間接ELISA等，其中，常規(guī)PCR在實(shí)驗(yàn)室快速診斷中的應(yīng)用越來越普遍[12-13]，然而PCV3在屠宰場的流行情況報(bào)道較少。因此，筆者等進(jìn)行了PCV3的PCR診斷方法研究，為PCV3在屠宰環(huán)節(jié)的分子流行病學(xué)調(diào)查研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)和豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)DNA模板由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 病料組織 采自 2018-2019年貴州省甕安縣、鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣、晴隆縣、關(guān)嶺縣、貴陽市烏當(dāng)區(qū)和清鎮(zhèn)市等7個(gè)屠宰場，共采集樣品376份，包括豬淋巴結(jié)和肺臟。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒(廈門百維信生物科技有限公司)，2×TaqMaster Mix和Goldview(天根生化科技有限公司)，DL 2000Marker、DL 1000 Marker(大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品)。

1.2 PCR檢測方法的建立

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)中的引物和Gen Bank中已公布的參考序列設(shè)計(jì) 1對引物，引物序列為:PCV3-F:5′-TTACTTAGAGAACGGACTTG

TAACG-3 ′，PCV3-R:5′-AAATGAGACACAGAGCTAT

ATTCAG-3′，目的片段為649 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.2 DNA模板提取 取病料組織約0.1 g，加入600 μL滅菌生理鹽水置于2 mLEP管后，采用上海凈信組織研磨儀研磨1 min后，將EP管于4 000 r/min離心3 min。用移液器吸取上層研磨液200 μL，加入蛋白酶K 5 μL，10%SDS溶液20 μL，搖勻置于55℃水浴鍋2 h后，用移液器吸取上層溶液200 μL置于DNA提取試劑盒第一孔，加入30 μL DTT溶液(1 mol/L)，用Lab-Aid820核酸提取儀進(jìn)行自動(dòng)提取[14]。

1.2.3 PCV3陽性模板的制備 以1.2.2提取的樣品DNA為模板，用引物PCV3 F和PCV3R進(jìn)行PCR反應(yīng)，將大小為649 bp的目的片段切膠回收，送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 對退火溫度(50℃、55℃、60℃、65℃)、延伸時(shí)間(60 s、65 s、70 s、75 s)、引物量(0.5 μL、1 μL)、模板量(1 μL、2 μL、3 μL)等4個(gè)變量對PCR檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 PCR特異性檢測 用1.2.3建立的PCR方法擴(kuò)增豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)，并以陽性質(zhì)粒和超純水依次作為陽性和陰性對照，檢測該P(yáng)CR方法的特異性。

1.2.6 PCR敏感性試驗(yàn) 采用Nanophotometer核酸儀測定陽性模板的濃度，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，將模板進(jìn)行倍比稀釋后，分別取2 μL作模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 臨床樣品PCR檢測

將2018-2019年采集的豬肺組織、淋巴結(jié)等376份病料組織按1.2.3建立的PCR方法進(jìn)行PCV3檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性模板

用引物PCV3 F和PCV3 R對樣品進(jìn)行擴(kuò)增，得到與預(yù)期相符的649 bp的目的條帶(圖1)。測序結(jié)果與NCBI公布的PCV3/CN/Jiangxi-62-2016毒株的同源性達(dá)99.54%，表明該DNA可作為陽性模板。

注：1為陰性對照，2為陽性模板，M為Marker DL2 000。
Note: 1，negative control; 2，positive template; M，Marker DL2 000.
圖1PCV3的 PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1 PCR amplification of PCV3

2.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)條件優(yōu)化，確定PCR最佳反應(yīng)為2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.3 PCR優(yōu)化方法的特異性

利用建立的最優(yōu)PCR反應(yīng)條件，對PRRSV、PRV、PPV進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果(圖2)表明，建立的PCR方法只能擴(kuò)增出PCV3樣品中的特異性目的片段，而對PRRSV、PRV、PPV均擴(kuò)增不出目的片段，建立的PCR方法特異性較好。

注：1為PRRSV病毒，2為PRV病毒，3為PPV病毒，4為陰性對照，5為PCV3陽性對照，M為Marker DL2 000。
Note：1，PRRSV virus; 2，PRV virus; 3，PPV virus; 4，negative control; 5，PCV3 positive control; M，Marker DL2 000.
圖2PCR特異性檢測結(jié)果
Fig.2 PCR specific detection results

2.4 PCR優(yōu)化方法的敏感性

測得陽性模板濃度為143.5 ng/μL，則不同稀釋度模板濃度依次為1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL。用建立的最優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，對不同稀釋度的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果(圖3)表明，建立的不同模板濃度PCR擴(kuò)增條帶隨模板濃度降低而逐漸減弱。

注：M為 Marker DL1000，1～6濃度依次為1.43×105pg/μL、1.43×104pg/μL、1.43×103pg/μL、1.43×102pg/μL、1.43×10 pg/μL、1.43 pg/μL；7為陰性對照。
Note：M，Marker DL1000; 1～6 means 1.43×105pg/μL，1.43×104pg/μL，1.43×103pg/μL，1.43×102pg/μL，1.43×10 pg/μL and 1.43 pg/μL respectivey. 7，negative control.
圖3PCR敏感性檢測結(jié)果
Fig.3 PCR sensitivity detection results

2.5 PCR優(yōu)化方法的臨床樣品檢測

用建立的最優(yōu)化PCR反應(yīng)條件對2018-2019年貴州各屠宰場376份組織的檢測結(jié)果(表1)顯示，其檢測出陽性樣品46份，2018年和2019年的陽性率分別為14.2%和11.6%。

表1 2018-2019年試驗(yàn)樣品 PCV3檢測結(jié)果Table 1 Detection results of tested PCV3 samples in 2018 and 2019

3 結(jié)論與討論

根據(jù)豬圓環(huán)病毒3型(Porcine circovirus type 3，PCV3)特異性序列設(shè)計(jì)引物，通過敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及測序驗(yàn)證后，建立的PCR方法確定PCR最佳反應(yīng)為2×Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，2 μL模板，dd H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 延伸5 min。特異性擴(kuò)增出649 bp的目標(biāo)片段，具有較好的敏感性，可擴(kuò)增的最低模板濃度為0.143 ng/μL；用建立的PCR方法對屠宰場送檢的376份組織樣品的檢測顯示，PCV3平均陽性率為12.9%，建立的PCR診斷方法較好。

目前，PCV3感染尚未列入世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)通報(bào)性疫病名錄及《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物檢疫疫病名錄》，該病毒隨生豬及其產(chǎn)品國際貿(mào)易傳播風(fēng)險(xiǎn)尚待評(píng)估[15]，且該病目前沒有疫苗，如毒力或致病力發(fā)生變化，屠宰場將是一個(gè)重要傳播源。試驗(yàn)建立了PCR診斷方法，對貴州多個(gè)屠宰場進(jìn)行檢測，將為PCV3在屠宰環(huán)節(jié)的分子流行病學(xué)調(diào)查研究奠定基礎(chǔ)。