花粉管通道法轉(zhuǎn)化荔枝的初步研究

王樹軍 孫進(jìn)華 李煥苓 王果 李芳 王家保

摘? 要：為開拓荔枝轉(zhuǎn)基因育種新途徑，以GUS基因作為報(bào)告基因，用花粉管通道法轉(zhuǎn)化授粉后24 h的‘新球蜜荔荔枝雌花，并統(tǒng)計(jì)座果率、成苗率、轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示：共獲得303株實(shí)生苗，經(jīng)PCR檢測(cè)和GUS染色法證實(shí)外源基因整合到4株荔枝苗基因組中，轉(zhuǎn)化率為1.32%。此研究結(jié)果為荔枝生物技術(shù)育種提供了一種簡單有效的途徑。

關(guān)鍵詞：荔枝;花粉管通道;轉(zhuǎn)基因;育種

中圖分類號(hào)：S667.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： In order to develop a new gene transformation pathway for litchi， the female flowers of Xinqiumili （24 h after pollination） were transformed by the pollen tube pathway method， using GUS as a report gene， and the fruit set percentage， seeding rate， and conversion rate were counted. A total number of 303 seedlings were obtained， and four positive transformed plants were verified according to PCR analysis and GUS staining， the transformation rate was 1.32%. This study would provide a simple and efficient way for the biotechnology breeding of litchi.

Keywords： litchi; pollen tube path; transgenic; breeding

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是華南重要的特色水果，其產(chǎn)業(yè)在區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但采前蒂蛀蟲危害和采后果皮褐變等問題限制了荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。培育多抗、優(yōu)質(zhì)耐貯的新品種是解決荔枝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的根本途徑。由于荔枝遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺乏抗性資源，使荔枝抗性育種進(jìn)展緩慢。但現(xiàn)代植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的興起與發(fā)展為荔枝育種提供了新方向。目前，已見報(bào)道的成功案例均是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[1]和基因槍法[2]實(shí)現(xiàn)荔枝轉(zhuǎn)基因育種，但這2種方法均必須經(jīng)過繁瑣的組織培養(yǎng)和再生過程，周期較長。Zhou等[3]在1983年首次提出花粉管通道法，該法巧妙利用有花植物授粉后形成的花粉管外通道，將外源DNA直接導(dǎo)入胚囊，對(duì)還處于融合期沒有形成細(xì)

胞壁的受精卵細(xì)胞或者是早期的胚胎細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。花粉管通道法操作簡單，技術(shù)成本低廉，不依賴于組織培養(yǎng)，直接從萌發(fā)的種子獲得實(shí)生苗篩選轉(zhuǎn)化株，是一種簡便、高效的轉(zhuǎn)基因方法[4]。自創(chuàng)立以來已在辣椒[5]、蝴蝶蘭[6]、鐵皮石斛[7]、黑楊[8]、番木瓜[9]等植物育種中得到應(yīng)用。本研究首次采用花粉管通道法對(duì)荔枝遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行探索，旨在尋找一種適用于荔枝的簡便、高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，為加速荔枝生物技術(shù)育種進(jìn)程提供基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地果園進(jìn)行，選取‘新球蜜荔品種為材料。在第1批雄花將謝，雌花即將大量開放時(shí)期，選擇花期相對(duì)一致、花穗多、樹體健壯的荔枝樹作為轉(zhuǎn)基因母樹。農(nóng)桿菌菌株選用EHA105，植物表達(dá)載體選用包含GUS基因的pCAMBIA1301質(zhì)粒。

1.2? 方法

1.2.1? 農(nóng)桿菌菌液的制備? 用熱激轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，恢復(fù)培養(yǎng)后在添加了卡那霉素（Kan）100?mg/L和利福平（Rif）100 mg/L的LB固體培養(yǎng)基上涂板，利用菌落PCR方法鑒定出陽性單菌落后培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基為LB+Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L，在200 r/min，28?℃條件下培養(yǎng)過夜。按1∶100的比例，轉(zhuǎn)接到含有Kan 100 mg/L+Rif 100 mg/L的1 L液體LB培養(yǎng)基中，在相同條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.8。將獲得的農(nóng)桿菌菌液5000 r/min離心10 min，收集菌體。然后用1 L轉(zhuǎn)化緩沖液重懸菌體至OD600值為0.8。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化緩沖液配方為：1/2 MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）+蔗糖（5 mg/L）+0.0l mg/L 6-BA，pH調(diào)至5.8。

1.2.2? 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對(duì)花粉萌發(fā)的影響? 在雄花盛花期，摘取帶有淡黃色雄花的花穗，保濕帶回實(shí)驗(yàn)室后，用鑷子將淡黃色雄花花朵摘下，置于40?℃的烘箱內(nèi)12?h，使其干燥散粉后，利用80目篩子收集金黃色花粉于2 mL離心管內(nèi)備用。

花粉萌發(fā)培養(yǎng)基的制備參照李煥苓等[10]方法，取10 g蔗糖和1 g瓊脂加入到0.5 mg/L硼酸水溶液100 mL，加熱溶解。待培養(yǎng)基溫度冷卻至不燙手，滴加1滴至曲面載玻片上，培養(yǎng)基凝固冷卻后備用。此外，分別制備1/2 MS、1/2 MS+ 100??mol/L AS、1/2 MS+Silwet L-77?（0.05% V/V）、1/2MS+100 ?mol/L AS+Silwet L-77（0.05% V/V）4種液體培養(yǎng)基以及OD600為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的農(nóng)桿菌菌液，用于重懸適量花粉，搖勻后靜置5 min，滴加1滴花粉液在冷卻的硼酸固體培養(yǎng)基上，將載玻片放置在28?℃且保濕的環(huán)境中。3?h后在Nikon ECLIPSE Ti顯微鏡下觀察載玻片上的花粉萌發(fā)情況。

1.2.3? 花粉管生長的熒光顯微觀察? 選取盛花期的花穗疏花，待雌花柱頭微微露白，去雄并套袋隔離。雌花柱頭開裂即將彎曲時(shí)進(jìn)行人工授粉并繼續(xù)套袋隔離。授粉后1～10?h，每隔1?h取樣1次;授粉后10～30 h，每隔2 h取樣1次;授粉后30～48 h，每隔6 h取樣1次。每次取10個(gè)雌蕊，用卡諾氏固定液固定12 h后轉(zhuǎn)入70%乙醇中低溫保存?zhèn)溆?。熒光顯微觀察前，用8 mol/L NaOH軟化雌蕊4～5 h，蒸餾水沖洗后，在0.05%苯胺藍(lán)溶液中染色4 h。壓片后，在ZEISS Stereo Lumar.V12顯微鏡356 nm波長下觀察，分別觀測(cè)柱頭上花粉的萌發(fā)和花粉管在花柱內(nèi)的生長情況。

1.2.4? 侵染轉(zhuǎn)化? 選好試驗(yàn)樹后，對(duì)花穗進(jìn)行疏花和去雄處理，保留柱頭未開裂的雌花，套袋隔離。待雌花柱頭開裂，將貯藏的花粉用授粉筆點(diǎn)授于雌花柱頭，套袋隔離。根據(jù)花粉管生長的熒光顯微觀察結(jié)果確定適宜的轉(zhuǎn)化時(shí)機(jī)。將制好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液倒入大燒杯中，浸沒授粉后的雌花花穗10?s。同時(shí)，選擇一些雌花用刀片從花柱基部切割柱頭后用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液浸沒10?s。對(duì)處理的花穗掛牌做標(biāo)記并做套袋處理，侵染結(jié)束1周后去除套袋。待果實(shí)成熟后統(tǒng)計(jì)座果率，公式如下：

座果率=果實(shí)數(shù)量/轉(zhuǎn)化雌花數(shù)量×100%。

取種子洗凈，播種，4周后統(tǒng)計(jì)成苗率，公式如下：

成苗率=成苗數(shù)量/播種種子數(shù)量×100%。

1.2.5? PCR檢測(cè)? 取播種后長成的實(shí)生幼苗葉片提取DNA，做PCR檢測(cè)。引物F和R根據(jù)潮霉素基因設(shè)計(jì)（引物序列：F： 5-AAAAGTTCGACA GCGTCTC-3;R： 5-GCGACCTCGTATT?GG?GA?A? T?C-3），PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性3 min;94?℃變性30 s，58?℃退火30 s，72?℃延伸1 min， 35次循環(huán);72?℃延伸5 min。統(tǒng)計(jì)陽性轉(zhuǎn)化率，公式如下：

轉(zhuǎn)化率=陽性苗數(shù)量/成苗數(shù)量×100%。

1.2.6? GUS組織化學(xué)染色? 取轉(zhuǎn)化2周后的部分幼果以及PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的實(shí)生幼苗的根和葉片，切成小塊，用無菌水清洗之后置于GUS染液[50 mmol/L pH 7.0磷酸鈉緩沖液、0.1 mmol/L K3[Fe（CN）6]、0.1 mmol/L K4[Fe（CN）6]、1 mmol/L Na2EDTA、0.1% Triton-100、20%甲醛、0.5 mg/mL X-Gluc加入中、37?℃染色過夜，酒精脫色后在OLYMPUS SZX7顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對(duì)花粉萌發(fā)影響研究

花粉管通道法大致有4種：柱頭涂抹法、浸泡法、斷口滴加法和注射法[11-14]。在應(yīng)用花粉管通道法轉(zhuǎn)化外源基因時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同物種花的特性及開花習(xí)性選擇適合的方法[15]。柱頭涂抹法、子房注射法、斷口滴加法，均適合用于子房較大的開花植物[16]。而荔枝花小而密，宜選擇浸泡法?；ǚ勰苷Ｃ劝l(fā)是花粉管通道法成功應(yīng)用的前提條件，因此首先開展了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液對(duì)‘妃子笑花粉萌發(fā)影響的研究。顯微觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)1/2 MS和1/2 MS+AS重懸后的花粉萌發(fā)率分別為34%和32%，而經(jīng)過1/2MS+Silwet L-77、1/2 MS+ AS+Silwet L-77和不同濃度的農(nóng)桿菌菌液重懸后的花粉萌發(fā)率均為0%。由此推斷，轉(zhuǎn)化液中的乙酰丁香酮（AS）不影響花粉萌發(fā)，但Silwet L-77和不同濃度的農(nóng)桿菌菌液均會(huì)抑制花粉萌發(fā)（圖1，圖2）。綜上可見，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液包裹荔枝花粉會(huì)抑制花粉萌發(fā)，導(dǎo)致無法形成花粉管通道。因此，花粉管通道法中農(nóng)桿菌就只能借助荔枝雌花授粉后已形成的花粉管通道到達(dá)胚囊。

2.2? 花粉管生長的熒光顯微觀察

選取‘新球蜜荔的雌花為母本，以‘妃子笑、‘新球蜜荔的花粉為父本，開展荔枝花人工授粉授精過程的研究，進(jìn)行花粉管通道生長的熒光顯微觀察。結(jié)果顯示，‘新球蜜荔雌花授粉后約8?h，花粉管伸長可達(dá)花柱道基部，約授粉16～18 h以后，花粉管穿過花柱道基部繼續(xù)向子房延伸。根據(jù)觀察結(jié)果確定授粉后24 h的雌花為理想的實(shí)驗(yàn)材料（圖3）。

2.3? PCR檢測(cè)

本研究共獲得376?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)化荔枝種子，播種后得到實(shí)生苗303株。提取幼苗葉片DNA后，經(jīng)PCR檢測(cè)證實(shí)獲得4株轉(zhuǎn)化株（圖4），轉(zhuǎn)化率為1.32%。此外，本研究還比較了柱頭切割對(duì)荔枝花粉管通道法的影響（表1），結(jié)果顯示，切割柱頭處理不能有效提高轉(zhuǎn)化效率，但會(huì)明顯降低座果率。

2.4? GUS組織化學(xué)染色

隨機(jī)取轉(zhuǎn)化2周后的20顆幼果進(jìn)行GUS染色，染色結(jié)果顯示有1顆幼果的胚可見藍(lán)色斑點(diǎn)。播種獲得的實(shí)生苗進(jìn)行PCR檢測(cè)后，隨機(jī)取陽性幼苗的根和葉片進(jìn)行GUS染色。染色結(jié)果顯示，

荔枝轉(zhuǎn)基因育種的新途徑具有重要的意義。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法均必須經(jīng)過周期較長的組織培養(yǎng)過程，而利用自身的生殖系統(tǒng)作為載體的花粉管通道法在轉(zhuǎn)基因育種中卻可避免繁瑣的組織培養(yǎng)和再生過程，能夠直接通過花粉管通道轉(zhuǎn)化目的基因，且還可克服遠(yuǎn)緣雜交的一些障礙，是一種便捷、有效的育種途徑。因?yàn)樵摲椒ㄔ趹?yīng)用中是通過收獲種子，播種后直接獲得轉(zhuǎn)化植株，因此，要選擇核大、豐產(chǎn)的荔枝品種進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如‘新球蜜荔。

花粉管通道法早期的應(yīng)用主要是將提取并純化的含有目的基因片段的質(zhì)粒DNA涂抹于雌花柱頭或通過微量注射器注入子房。但由于‘新球蜜荔雌花盛開的季節(jié)海南正處高溫天氣，且實(shí)驗(yàn)是在田間活體開展，裸露的質(zhì)粒DNA在陽光強(qiáng)烈的高溫環(huán)境下易降解，難以達(dá)到轉(zhuǎn)化目的。因此，本研究在探明花粉管通道萌發(fā)生長規(guī)律的基礎(chǔ)上，選擇授粉后24?h為最佳的轉(zhuǎn)化時(shí)機(jī)，借助農(nóng)桿菌攜帶質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并初步鑒定獲得轉(zhuǎn)基因?qū)嵣酌纭＝柚ǚ酃芡ǖ朗褂棉r(nóng)桿菌侵染的轉(zhuǎn)化方法，首先要排除農(nóng)桿菌自身造成的檢測(cè)干擾。因此，本研究選擇載體pCAM?B?I?A?1301中含有內(nèi)含子的GUS基因作為報(bào)告基因，因?yàn)檗r(nóng)桿菌等原核生物細(xì)胞在基因轉(zhuǎn)錄過程中沒有剪接內(nèi)含子的能力，所以含有內(nèi)含子的基因只能在真核生物細(xì)胞中表達(dá)而不能在原核生物細(xì)胞中表達(dá)[20]，從而避免農(nóng)桿菌自身的GUS染色干擾。

花粉管通道法結(jié)合農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)受外界環(huán)境條件影響較大。結(jié)果表明，本研究中荔枝的座果率較低，可能是與花期恰遇連續(xù)陰雨天氣有關(guān)。座果率是影響花粉管通道法轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。在實(shí)際的操作中可通過采取一些有效措施來提高座果率，比如選擇晴天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避開中午高溫天氣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化侵染后套袋等。因?yàn)榛ㄆ谟晁畷?huì)導(dǎo)致落果，而睛天中午強(qiáng)烈的太陽強(qiáng)紫外線會(huì)降低農(nóng)桿菌活性，套袋則既可避免雨水打濕，又可避免陽光直射。另外，部分研究表明，花粉管通道法轉(zhuǎn)基因操作步驟中會(huì)有切割柱頭的處理，目的是縮短侵染路徑，但荔枝花較小，柱頭本身較短，所以影響不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，切割柱頭并不能有效提高轉(zhuǎn)化效率，反而會(huì)明顯降低座果率，還會(huì)數(shù)倍增加工作量，降低實(shí)驗(yàn)效率。

本研究先通過潮霉素抗性基因PCR檢測(cè)初步確定了4株轉(zhuǎn)基因?qū)嵣酌?，為不影響幼苗的正常生長，僅在葉片和根部隨機(jī)取樣進(jìn)行GUS染色，結(jié)果均呈陽性，這進(jìn)一步證明外源基因整合到了荔枝基因組內(nèi)。但由于GUS基因表達(dá)的豐度差異，顯色部位多集中在葉脈和根尖。至于是否能穩(wěn)定遺傳，還需要對(duì)實(shí)驗(yàn)植株的下一代進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究首次將花粉管通道法用于將外源基因?qū)肜笾?，但是轉(zhuǎn)化效率不理想，后續(xù)研究將在本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系，對(duì)影響因素進(jìn)行深入細(xì)致研究，以期建立簡便、高效、穩(wěn)定的荔枝花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

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