海南甘薯主栽品種再生體系的優(yōu)化

孫言博 祝志欣 黃婷 李思明 朱國鵬

摘? 要：本研究以海南甘薯主栽品種‘心香、‘廣薯87、‘川山紫、‘寧紫薯1號、‘薯綠一號、‘高系14和‘三角寧為材料，從外植體的選擇、不同消毒方案、培養(yǎng)基配方和防褐化劑篩選等方面進行研究，建立一套適合熱帶地區(qū)甘薯主栽品種的脫毒快繁優(yōu)化再生體系。結(jié)果表明：側(cè)芽增殖率與存活率最高;在不同的外植體消毒處理中，依次用75%酒精消毒60 s，2% NaClO消毒15 min，以及0.1% HgCl2消毒15 min的污染率最低;最佳的生根培養(yǎng)基配方為：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3;莖長生長最快的培養(yǎng)基配方為：MS+0.1 mg/L NAA+1?mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3;干重增長最快的培養(yǎng)基配方為：MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3;在培養(yǎng)基中加入5～6 g/L硫代硫酸鈉和1.25 g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效地抑制外植體的褐變。

關(guān)鍵詞：甘薯;再生體系;培養(yǎng)基配方;外植體褐變

中圖分類號：S531????? 文獻標識碼：A

Abstract： In this study， the main sweet potato varieties planted in tropical areas， including ‘Xinxiang， ‘Guangshu 87， ‘Chuanshan Zi， ‘Ning Zishu 1， ‘Shulv 1， ‘Gaoxi 14 and ‘Sanjiao Ning were used as the materials. The selection of explants， disinfection schemes， medium formulation and anti-browning agent were explored. The optimum regeneration system of virus-free and rapid propagation was established for the main sweet potato varieties. The proliferation rate and survival rate of lateral buds were the highest among different parts of explants. In treatments of different explant disinfection， 75% alcohol for 60 s， 2% sodium hypochlorite for 15 min， and 0.1% mercury chloride for 15 min exhibited the lowest contamination rate. The medium formula with the shortest rooting time was as follows： MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3. The medium formula with the fastest growth of stem length was as follows： MS+0.1?mg/L?NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3. The medium formula with the fastest growth rate of dry weight was as follows： MS+0.1 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3. Adding 5–6 g/L sodium thiosulfate and 1.25 g/L polyvinylpyrrolidone to the medium could effectively inhibit the browning of explants.

Keywords： sweet potato; regeneration system; medium formula; browning of explants

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam]又名紅薯、番薯、地瓜等，為旋花科甘薯屬多年生草本植物，原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，廣泛種植于100多個國家，是我國重要的糧食、經(jīng)濟和能源作物。我國約有2000份甘薯種質(zhì)資源[1]，適應(yīng)于中國不同的地區(qū)。海南地區(qū)氣候獨特，甘薯可作為蔬菜或糧食全年種植，尤其以秋冬種植面積最大[2]。

甘薯各品種主要依靠無性繁殖，在長期的栽培過程中常因病毒的感染而退化，導致產(chǎn)量和品質(zhì)嚴重受損[3]。甘薯的主要病毒，如羽狀斑駁病毒、潛隱病毒、黃矮病毒、明脈病毒和叢枝病毒病，已經(jīng)成為制約甘薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。利用組織培養(yǎng)技術(shù)，快速地生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)無病毒的種苗是甘薯產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要保障。目前，組培技術(shù)已經(jīng)成熟運用于優(yōu)質(zhì)甘薯種苗培育中，但是不同品種的甘薯培養(yǎng)條件、成苗時間、成苗率差異極大，如Dessai等[4]對27種不同基因型甘薯組培，發(fā)現(xiàn)部分基因型甘薯組培苗生根時間不超過27 d，其他則需要28～40 d。董芳等[5]提出湘薯系列的最優(yōu)植物激素添加方案為MS培養(yǎng)基中加入0.67～1.00 mg/L NAA和2.0～3.0 mg/L 6-BA。秦梅等[6]則認為，‘徐薯22薯適宜的莖尖分化培養(yǎng)基配方中應(yīng)加入0.2 mg/L NAA和0.5 mg/L 6-BA。張寶紅[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的甘薯組培時愈傷組織出根率和芽分化率差異極大。

此外，大量研究表明，由于次生代謝產(chǎn)物氧化而引起的褐變，以及微生物造成的污染是甘薯組織培養(yǎng)的2大難題[8-9]。甘薯組培苗生產(chǎn)過程中，輕度褐變會影響甘薯初接種外植體生根發(fā)芽效率，嚴重褐變會直接導致外植體死亡[10]。因此，針對特定地區(qū)的環(huán)境條件和品種，以及組織培養(yǎng)過程中的外植體褐化及微生物污染等關(guān)鍵問題，建立一套相對完善的甘薯再生體系是生產(chǎn)脫毒苗的重要環(huán)節(jié)。

本研究以海南甘薯主栽品種‘心香、‘廣薯87薯、‘川山紫、‘寧紫薯1號、‘薯綠一號、‘高系14系和‘三角寧為原材料，從外植體的選擇、不同消毒方案、培養(yǎng)基配方和防褐化劑篩選等方面進行研究，建立一套適合熱帶地區(qū)甘薯主栽品種的脫毒快繁優(yōu)化再生體系。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試甘薯品種? ‘心香、‘廣薯87薯、‘川山紫、‘寧紫薯1號、‘薯綠一號、‘高系14系和‘三角寧均為南方地區(qū)普遍栽培品種，由海南大學園藝學院甘薯種質(zhì)資源圃種植保存。

1.1.2? 主要儀器? 超凈臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-2D;接種器械滅菌器，上海農(nóng)卉生物科技有限公司NH-JZ-330;高壓滅菌鍋，美國致微高壓滅菌鍋G154DW;分析天平，型號為賽多利斯科學儀器（北京）有限公司的2-16P。

1.1.3? 實驗選用的基本培養(yǎng)基及主要試劑? MS培養(yǎng)基（青島海博生物）：取41.7 g的MS培養(yǎng)基溶于1 L純水，按各實驗需求加入植物激素或防褐化劑，調(diào)節(jié)pH至（5.7±0.1），倒入洗凈的組培瓶中，每個組培瓶裝30 mL培養(yǎng)基，121 ℃高溫高壓滅菌20 min后冷卻備用。萘乙酸（NAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、次氯酸鈉（NaClO）和氯化汞（HgCl2）購買自上海生工生物，均為分析純。

1.2? 方法

1.2.1? 不同部位外植體組培生長對比? 選取‘廣薯87薯、‘川山紫、‘三角寧、‘高系14系、‘薯綠一號和‘心香6個甘薯品種生長期約3個月的健康植株帶回實驗室，剪去多余的葉片，用清水徹底清洗，分別切取每個品種的頂芽、側(cè)芽、莖段作為外植體。莖段切取所選擇的部位為莖上靠近頂芽的部位，每段長1 cm，共取60份;側(cè)芽選擇切取發(fā)育較好，結(jié)構(gòu)完整的側(cè)芽，每份長約0.5 cm，共取60份;頂芽則選取發(fā)育好，結(jié)構(gòu)完整的，切取長約0.5 cm，共取60份。將不同部位的60份外植體隨機分為3組作為重復，每組20份，每次實驗使用其中1組材料。切取完所需材料后，將3份不同的材料分別裝入消毒容器中后，在無菌操作臺中，先用75%的酒精消毒30 s，接著用無菌蒸餾水清洗1 min，然后用0.1%的HgCl2消毒10 min，最后用無菌蒸餾水清洗3次，每次3 min。消毒完畢將外植體接種于已制備好的MS基本培養(yǎng)基中，做好標記，培養(yǎng)30 d后觀察并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.2? 外植體的消毒方法優(yōu)化? 選取健康的‘川山紫植株若干，剪去多余的葉片及幼嫩分支，取上半部主莖用清水洗凈。用手術(shù)刀切取長約0.5 cm莖尖作為外植體，以75%酒精消毒時間，2% NaClO消毒時間，HgCl2濃度及HgCl2消毒時間作4因素4水平正交實驗（L1643）。由于消毒劑殘留會對植物細胞造成傷害，且會影響下一步消毒，因此每次經(jīng)過消毒試劑處理后，都需要用無菌水漂洗以去除在外植體上的殘留消毒劑。酒精每次處理后進行1 min/次的漂洗，漂洗1次; NaClO每次處理后漂洗2 min，漂洗2次;HgCl2每次處理后漂洗3 min，漂洗3次。消毒完畢接種于MS基本培養(yǎng)基中，每天觀察1次并記錄。

1.2.3? 培養(yǎng)基配方的優(yōu)化實驗? 選取健康的‘川山紫莖尖若干，以MS作為基本培養(yǎng)基，選用NAA、6-BA、GA3共3種激素。各激素取4個水平作正交設(shè)計組成16組不同配方（L1643）對甘薯外植體進行組織培養(yǎng)。定期觀察并記錄各組處理生根時間，40 d后觀察并測定外植體的莖長及干重，找出適于甘薯組培的激素配比。采用的外植體消毒處理方法為優(yōu)化后的消毒方案：75%酒精消毒60?s，2% NaClO消毒15?min，0.1% HgCl2消毒15?min。

1.2.4? 防褐化劑的篩選? 選取健康的‘川山紫莖尖若干，消毒方法為優(yōu)化后的消毒方案，培養(yǎng)基配方為優(yōu)化后的生根培養(yǎng)基，同時加入需篩選的防褐化劑。使用的防褐化劑為抗壞血酸、硫代硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮，活性炭和檸檬酸。

1.2.5? 指標測定? 生根時間測定：生根的標準為觀察到外植體有明顯露白，每天觀察1次;莖長及干重測定時間：種植于培養(yǎng)基上后40 d，采取瓶外測量;莖長測量：運用游標卡尺對外植體進行測量;干重測量：100?℃烘12 h后測干重，使用分析天平對外植體進行測量。

出芽率=出芽個數(shù)/總接種個數(shù)×100%;

污染率=污染數(shù)/總接種個數(shù)×100%;

褐化率=褐化數(shù)/總接種個數(shù)×100%;

死亡數(shù)=污染數(shù)+褐化數(shù)+玻璃化數(shù);

死亡率=死亡數(shù)/總接種個數(shù)×100%;

存活率=（總接種個數(shù)死亡數(shù)）/總接種個數(shù)×100%。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行多因素方差分析（ANOVA）和極差分析，計算不同品種外植體出芽率、存活率、生根時間、莖長和干重，并進行Duncan s多重比較分析，采用Excel 2010軟件制圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同外植體的選取對組培的影響

各甘薯品種不同部位外植體發(fā)芽率的統(tǒng)計結(jié)果見圖1，側(cè)芽出芽率顯著高于頂芽，頂芽顯著高于莖段。如?？诘貐^(qū)廣泛種植的‘三角寧品種，側(cè)芽出芽率顯著高于頂芽與莖段。存活率的統(tǒng)計結(jié)果見圖2，頂芽與側(cè)芽均具有較高的存活率，其中側(cè)芽表現(xiàn)略優(yōu)于頂芽，不同品種莖段的存活率差異顯著。結(jié)合圖1與圖2可以看出，6個甘薯品種的出芽率與存活率中，側(cè)芽高于頂芽，莖段最低。

2.2? 消毒方案對存活率的影響

以75%酒精消毒時間，2% NaClO消毒時間，HgCl2濃度及HgCl2消毒時間作4因素4水平正交實驗（L1643），每組接種30個‘川山紫莖尖外植體。通過污染數(shù)、玻璃化與褐化數(shù)的統(tǒng)計，16組消毒方案的污染率、存活率情況如表1所示。從方差角度，HgCl2濃度對存活率有顯著影響（P<0.05），其他因素的影響不顯著。對不同消毒因素污染率的方差分析顯示，HgCl2濃度對污染率有顯著影響（P<0.05），其他3個因素影響不顯著（表1）。

對不同消毒因素的最優(yōu)方案可通過極差值和水平均數(shù)獲得（表2）。由表2可知，對污染率影響力由大至小依次為：HgCl2濃度>HgCl2時間> NaClO時間>酒精時間。各水平均數(shù)代表該水平對應(yīng)的平均污染率，水平均數(shù)越高說明污染率越高，因此，不同消毒因素中水平均數(shù)最小的為最優(yōu)水平，即酒精處理時間的水平3、NaClO處理時間的水平4、HgCl2濃度的水平4和HgCl2時間的水平3。

綜合方差和極差分析，‘川山紫組織培養(yǎng)過程中污染率最小的最優(yōu)消毒方案為：依次用75%酒精消毒45 s，2% NaClO消毒15 min，0.4% HgCl2消毒15 min。

為保證較高的存活率，需對不同消毒因素的存活率進行極差分析（表3）。由表3可知，極差值大小排序表明各消毒因素對存活率的影響力：HgCl2濃度>HgCl2時間>NaClO時間>酒精時間。各水平均數(shù)大代表該水平對應(yīng)的平均存活率大，不同消毒因素中水平均數(shù)最大的即為最優(yōu)水平，即酒精處理時間的水平4、NaClO處理時間的水平4、HgCl2濃度的水平1、HgCl2時間的水平3。

綜合方差和極差分析，‘川山紫組織培養(yǎng)過程中污染率較小且存活率最高的最優(yōu)消毒方案為：75%酒精消毒60 s，2% NaClO消毒15 min，0.1% HgCl2消毒15 min。

2.3? 培養(yǎng)基激素配方對外植體生長的影響

對NAA、6-BA、GA3激素各取4個水平做正交設(shè)計，組成16組不同配方（L1643），對‘川山紫莖尖外植體進行組織培養(yǎng)的生根時間、培養(yǎng)40 d后莖長及干重的方差分析結(jié)果如表4所示，NAA對生根時間有顯著影響（P=0.001）。

對NAA、6-BA、GA3的極差分析結(jié)果見表5。由表5可知，NAA為影響生根時間最主要因素，且NAA取第3水平，6-BA取第1水平，GA3取第2水平時生根時間最短。GA3為影響莖長最主要因素，且NAA取第4水平，6-BA取第3水平，GA3取第4水平時莖長最大。NAA為影響干重增長最主要因素，且NAA取第4水平，6-BA取第4水平，GA3取第4水平時干重增長最快。

綜合方差和極差分析結(jié)果，生根時間最短的培養(yǎng)基配方為：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3。莖長增長最快的培養(yǎng)基配方為：MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L?GA3。干重增長最快的培養(yǎng)基配方為：MS+0.1?mg/L?NAA+1.5?mg/L?6- BA+0.5?mg/L?GA3。

2.4? 不同防褐化劑的效果

防褐化實驗中，不加任何抑制劑的處理中，外植體褐變率非常高，而加入褐變抑制劑后，褐變程度都有所減輕（表6，圖3）。對照組的平均褐變率為86.7%，說明褐變非常普遍?？箟难幔ˋ組）中A3的效果最好，平均褐變率為46.7%。硫代硫酸鈉（B組）中B2和B3效果差別不明顯，平均褐變率分別為8.0%和6.7%。聚乙烯吡咯烷酮（C組）中3組整體情況大體相同，平均褐變率在30%左右。活性炭（D組）中D3效果最好，平均褐變率為20%。而檸檬酸（E組）中3組呈濃度梯度，濃度越高效果越好。

綜合來說，硫代硫酸鈉的防褐化效果較好，聚乙烯吡咯烷酮的抑制效果比較均勻，檸檬酸和活性炭的整體效果差異不明顯，抗壞血酸的效果在幾組中表現(xiàn)較差。在甘薯組織培養(yǎng)中，5～6 g/L硫代硫酸鈉和1.25?g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效地抑制外植體的褐變。

3? 討論

外植體部位、消毒方案、培養(yǎng)基配方以及防褐化劑的選擇是熱帶地區(qū)甘薯主栽品種的再生體系構(gòu)建的關(guān)健技術(shù)環(huán)節(jié)。本研究表明，比較不同部位外植體存活率，應(yīng)優(yōu)先選擇側(cè)芽和頂芽，最后為莖段。芽作為生長點含有大量生長素等激素類物質(zhì)，出芽率會明顯高于莖段。類似的結(jié)果在菊花組織培養(yǎng)中也有體現(xiàn)，帶芽莖段作外植體優(yōu)于其他部位[11]。本研究中，甘薯芽的成苗率明顯高于莖段，且側(cè)芽要優(yōu)于頂芽，推測是頂芽的生長素過高，抑制生長導致。此外，本研究結(jié)果表明，甘薯莖段作外植體時存活率波動較大，可能是不同品種甘薯莖段中所含微生物種類不同，其導致消毒效、污染率的不同，最終導致了存活率的較大波動。

在消毒方式的影響實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)，成苗率與消毒劑的濃度及處理時間密切相關(guān)。高濃度消毒劑污染程度雖低，但成苗率也不高。過高的消毒劑濃度和過長的消毒時間可損傷植物材料，導致隨后的組培過程中的玻璃化或褐化死亡的情況，宜選用較低濃度的HgCl2與NaClO聯(lián)合進行消毒。李鴻雁[12]在研究紫色甘薯組培快繁體系時認為0.2% HgCl2的溶液消毒6 min，可達到理想的消毒效果。趙雨佳等[13]在高淀粉甘薯莖尖脫毒與組培技術(shù)研究中提出外植體用0.1%升汞溶液消毒7～8 min消毒效果理想。李懷情等[14]在研究‘紫云甘薯快繁技術(shù)時發(fā)現(xiàn)，濃度高的消毒劑雖然滅菌效果較好，但對外植體的傷害也較大，嚴重的會導致褐化死亡。本研究的實驗結(jié)果與以上學者的結(jié)論基本一致。

在植物激素的影響實驗中，激素的配比對成苗速度有顯著影響。其中NAA為生長素，具有促進植物伸長生長、促進插枝生根的作用。6-BA為細胞分裂素，具有促進細胞分裂和擴大，誘導芽的分化，延緩葉片衰老的作用。GA3為赤霉素，具有促進細胞伸長，從而引起莖稈伸長和增高的作用。顧淼[15]在‘商薯19薯的組培中認為在培養(yǎng)基中加入適量的6-BA和NAA有利于芽的誘導分化，且濃度過高或過低都會抑制外植體的生長。王穎[16]在‘商薯19薯的組培結(jié)果中發(fā)現(xiàn)6-BA可有效誘導苗的增殖，但較低濃度的效果不佳，且6-BA與NAA的組合不利于葉的生長。張軍云等[17]認為紫甘薯的最適培養(yǎng)基分別為：初代培養(yǎng)基MS+2.0?mg/L 6-BA，增殖培養(yǎng)基MS+ 1.0?mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA，生根培養(yǎng)基1/2 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IAA。本研究同樣選用了6-BA與NAA作為培養(yǎng)基添加激素，且最終確定的最優(yōu)濃度與以上結(jié)果類似，并未存在較大范圍偏差，可認為本研究確定的激素濃度水平適宜所選定甘薯品種的再生培養(yǎng)。

對于組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象，周俊輝等[18]認為，對母株和外植體的預(yù)處理、創(chuàng)造適宜的培養(yǎng)條件、或在培養(yǎng)基中加入抑制劑等措施均可減少褐化現(xiàn)象的發(fā)生。張赟彬等[19]對各褐變抑制劑的效果強度排序為：亞硫酸鈉>抗壞血酸>檸檬酸。在單一抑制劑浸泡實驗中，檸檬酸效果最好，抗壞血酸效果最差，而亞硫酸鈉對浸泡時間長短的作用表現(xiàn)不明顯。陳吉裕等[20]在研究延齡草無菌培養(yǎng)體系的建立及防褐變措施時得出結(jié)論，抗壞血酸、活性炭和聚乙烯吡咯烷酮均可明顯降低延齡草根莖組培種的褐變率，3種添加成分抑制褐變的效果沒有明顯差異，但活性炭防褐變效果相對最好，抗壞血酸次之，聚乙烯吡咯烷酮效果最差。本研究在設(shè)計時同時考慮了5種防褐化劑的效果，發(fā)現(xiàn)硫代硫酸鈉效果最好。當比較抗壞血酸和檸檬酸時，發(fā)現(xiàn)兩者差別不大，這與張赟彬等[19]研究結(jié)論略有出入。當比較抗壞血酸、活性炭和聚乙烯吡咯烷酮時，其研究結(jié)論與陳吉裕等[20]完全一致，即防褐化劑對不同植物材料的組培作用效果相似。因此，可將本研究結(jié)論推廣至其他植物組培中。

綜上，本研究結(jié)果表明，不同部位外植體中側(cè)芽增殖率與存活率最高。在不同的外植體消毒處理中，依次用75%酒精消毒60 s，2% NaClO消毒15 min，以及0.1% HgCl2消毒15 min的污染率最低。最佳的生根培養(yǎng)基配方為：MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3;莖長生長最快的培養(yǎng)基配方為MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L GA3;干重增長最快的培養(yǎng)基配方為：MS+0.1 mg/L NAA+ 1.5 mg/L 6-BA+0.5?mg/L?GA3。在培養(yǎng)基中加入5～6?g/L硫代硫酸鈉和1.25?g/L聚乙烯吡咯烷酮能有效地抑制外植體的褐變。

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