RP-HPLC法測(cè)定復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量的方法學(xué)研究

劉元元，張麗芳，張崇，車傳燕，王艷玲,2，苗晉鋒，鄧旭明*

(1. 吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；2. 青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266111；3. 上海獸藥研究所，上海 201203；4. 安徽科技學(xué)院，安徽 滁州 233100；5. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

布他磷(butafosfan)是一種白色結(jié)晶性粉末，無臭的氨基丙磷化合物，極易溶解于水，是由德國Bayer公司于1958年開發(fā)生產(chǎn)的一種有機(jī)磷補(bǔ)充劑，具有促進(jìn)代謝、增強(qiáng)免疫以及抗應(yīng)激等功效[1-2]。課題組對(duì)該藥及其制劑進(jìn)行了研制開發(fā)，為確保新藥質(zhì)量，對(duì)復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量的測(cè)定方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究[3]。布他磷的化學(xué)結(jié)構(gòu)不含共扼雙鍵結(jié)構(gòu)，因此，本類化合物無紫外吸收[4-5]。考慮到示差折光檢測(cè)器是通用型檢測(cè)器，本研究采用液相色譜示差折光檢測(cè)法進(jìn)行復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量的測(cè)定，結(jié)果顯示該方法具有較高的專屬性和靈敏度，為國內(nèi)外首次報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters e2695型 )，檢測(cè)器為Waters 2414型示差折光檢測(cè)器； C8色譜柱(粒度：5 μm，4.6×250 mm，SunFireTM)。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。復(fù)方布他磷注射液(青島蔚藍(lán)生物股份有限公司研制)；布他磷對(duì)照品(青島蔚藍(lán)生物股份有限公司研制，含量：99.8%)。

1.2 色譜條件

色譜柱：C8(5 μm，4.6×250 mm，SunFireTM),流動(dòng)相：甲醇：0.2% 磷酸水溶液(8∶92,V∶V)；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：20 min。

1.3 溶液的制備

供試品溶液的制備：精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取供試品溶液 1mL，置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

對(duì)照品溶液的制備：取對(duì)照品約0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻。

測(cè)定方法：分別取對(duì)照溶液和供試品溶液各10 μL 注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

1.4 方法學(xué)考察

依據(jù)《獸用化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》，對(duì)研制的復(fù)方布他磷注射液進(jìn)行了系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、專屬性、線性、精密度、回收率、溶液穩(wěn)定性考察。

1.4.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)與專屬性

取布他磷對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣，分別記錄液相色譜圖，計(jì)算理論塔板數(shù)、布他磷與相鄰的雜峰布他磷氧化物的分離度，考察該方法的系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性。

1.4.2 線性考察

取布他磷對(duì)照品0.2 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.8、0.9、1.0、1.1和1.2 mL分別置10 mL量瓶中配制成一系列濃度的溶液，分別進(jìn)樣10 μL，將測(cè)得的布他磷的峰面積對(duì)樣品濃度進(jìn)行線性回歸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 精密度、回收率、中間精密度

取布他磷對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6針，記錄布他磷主峰面積，計(jì)算RSD，得中間精密度。分別精密稱取布他磷原料80、100和120 mg，每個(gè)稱樣量平行三份共9份，并加入處方量的維生素B12及其它輔料，分別置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取2 mL置10 mL量瓶中，用加流動(dòng)相稀釋至刻度，制備得到三種濃度的供品溶液。另取布他磷對(duì)照品0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取上述兩種溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。取批號(hào)20120423的復(fù)方布他磷注射液樣品5份，由兩人按供試品溶液制備項(xiàng)操作，按測(cè)定法進(jìn)樣計(jì)算布他磷峰面積及RSD，得中間精密度。

1.4.4 溶液的穩(wěn)定性

取批號(hào)20120423的復(fù)方布他磷注射液樣品溶液，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)下，分別在0、0.5、22和24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算布他磷色譜峰面積，從而考察檢測(cè)樣品常規(guī)放置24h的穩(wěn)定性。

1.4.5 樣品含量測(cè)定

取3批本品樣品，按供試品溶液制備項(xiàng)操作，按樣品含量測(cè)定法測(cè)定布他磷標(biāo)示含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)和專屬性

通過對(duì)復(fù)方布他磷注射液主成分及降解產(chǎn)物布他磷氧化物進(jìn)行HPLC分離檢測(cè)，結(jié)果顯示布他磷的理論塔板數(shù)大于5 000。由圖1、圖2、圖3可知本方法條件下布他磷與相鄰的雜峰布他磷氧化物的分離度>1.5，表明本方法的系統(tǒng)適應(yīng)性和專屬性良好。

圖1 復(fù)方布他磷注射液系統(tǒng)適應(yīng)性色譜

圖2 布他磷氧化物(A)和布他磷(B)的色譜

圖3 布他磷氧化物(上)和布他磷(下)的色譜

2.2 線性考察結(jié)果

線性結(jié)果表明，布他磷濃度在0.64～0.96 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系(見表1和圖4)?；貧w系數(shù)r2=0.999 2。

表1 布他磷線性測(cè)定結(jié)果

濃度/(mg·mL-1)峰面積0.640 6388 7800.720 7435 9960.800 8482 6480.880 9534 9770.961 0577 114

圖4 布他磷濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 精密度、回收率、中間精密度和溶液穩(wěn)定性

精密度結(jié)果見表2，本法的精密度良好。回收率測(cè)定結(jié)果見表3，本方法對(duì)高、中和低三種濃度下布他磷的回收率均大于99%，表明回收率良好。中間精密度結(jié)果見表4，RSD=0.18%，表明該方法中間精密度良好。溶液的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果見表5，結(jié)果表明布他磷溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

綜上方法學(xué)各參數(shù)的考察，說明本方法完全能滿足檢測(cè)要求。

表2 布他磷精密度結(jié)果

序號(hào)峰面積(mAu?s)平均值(mAu?s)RSD/%148506324831293481809448398954818226482633483 074.20.26

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

復(fù)方布他磷注射液三批供試品結(jié)果(表6)表明，樣品中的布他磷含量測(cè)定結(jié)果均在標(biāo)示含量的95.0%～105.0%，符合規(guī)定。

表3 布他磷回收率測(cè)定結(jié)果

序號(hào)加樣量(mg)測(cè)得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD180.480.3899.97280.579.8899.22380.480.3199.8999.690.414100.9100.5099.605100.7101.19100.486100.3101.13100.82100.30.637119.6121.00101.178120.4120.75100.299120.0120.44100.36100.60.48

表4 布他磷中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

序號(hào)布他磷峰面積(mAu?s)平均峰面積(mAu?s)RSD(%)1475 3712476 4293475 2714477 3235475 850476 048.80.18

表5 布他磷溶液穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

時(shí)間/h布他磷峰面積(mAu?s)平均峰面積(mAu?s)RSD(%)0476 0190.5475 37122474 75324482 439477 1450.13

表6 復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量測(cè)定結(jié)果

批號(hào)201204232012042520120427布他磷標(biāo)示含量/%100.898.5103.2

3 討論與小結(jié)

2011版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量測(cè)定方法是采用的非水電位滴定法，該方法的原理就是利用布他磷顯弱酸性的化學(xué)性質(zhì)，以強(qiáng)堿性的四丁基氫氧化銨作為滴定劑，以甲醇和N,N-二甲基甲酰胺作為溶劑，進(jìn)行電位滴定來測(cè)定布他磷的含量[4]?？紤]到本研究的復(fù)方布他磷注射液的處方中含有乙酸這一酸性物質(zhì)，如采用進(jìn)獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的布他磷含量測(cè)定方法方法，必定影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，本研究通過試驗(yàn)摸索，采用了液相色譜法進(jìn)行布他磷含量測(cè)定，由于布他磷紫外無吸收[5]，不能用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，因此采用了示差折光檢測(cè)器。

該方法將布他磷及有關(guān)物質(zhì)布他磷氧化物成功進(jìn)行了分離，專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性良好，可同時(shí)滿足復(fù)方布他磷注射液中布他磷的含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。本研究主要進(jìn)行了主成分布他磷含量測(cè)定的方法學(xué)研究，系統(tǒng)考察了線性、精密度、回收率、中間精高密度、測(cè)定樣品放置穩(wěn)定性等，結(jié)果表明，該方法簡便、準(zhǔn)確、精密度高、重復(fù)性好，可用于復(fù)方布他磷注射液中布他磷含量的測(cè)定，為復(fù)方布他磷注射液有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定及其方法學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。