響應(yīng)面法優(yōu)化堿煉工藝脫除玉米油中玉米赤霉烯酮的研究

王英丹，馬傳國,2*，黃偉鋒，李利君,2，劉 偉，陳小威，陳復(fù)生

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.河南工業(yè)大學(xué) 小麥和玉米深加工國家工程實驗室，河南 鄭州 450001

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又稱F-2毒素，分子式為C18H22O5，熔點為165 ℃，ZEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1]。從圖1可以看出，ZEN的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)占總分子結(jié)構(gòu)的比例較高，因而極性較弱。ZEN幾乎不溶于水、四氯化碳等強極性或非極性溶劑，但在堿性溶液中溶解度較好，在乙腈、甲醇、二氯甲烷等有機溶劑中溶解度良好[2]。研究表明，ZEN具有類雌激素作用，對人和動物有一定的生殖毒性，還會產(chǎn)生細(xì)胞毒性和遺傳毒性，損傷肝腎并降低免疫機能，其毒性與暴露的水平、攝入量直接相關(guān)[3-4]。

圖1 玉米赤霉烯酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of zearalenone

玉米是我國的主要糧食作物之一，以玉米胚芽為原料生產(chǎn)的玉米油含有多種不飽和脂肪酸、甾醇、生育酚、亞麻酸等生物活性物質(zhì)，玉米油中人體必需脂肪酸亞油酸的含量達(dá)到46%～60%[5-7]。玉米油因具有預(yù)防動脈硬化、調(diào)節(jié)血脂的功效及營養(yǎng)價值高而成為人們越來越關(guān)注的營養(yǎng)保健油脂[8]。調(diào)查研究表明，玉米及其深加工產(chǎn)品受ZEN的污染較為嚴(yán)重[9-10]。周建川等[11]對2017年我國飼料原料中真菌毒素的污染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，玉米和玉米副產(chǎn)物中ZEN的檢出率分別為80.25%和88.89%，超標(biāo)率分別達(dá)到2.47%和28.89%。張毅等[12]對2017年天津市售100份植物油進行了真菌毒素污染情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)ZEN的檢出率為53.00%，最高含量為384.89 μg/kg。由于玉米油的生產(chǎn)原料多為工廠生產(chǎn)的副產(chǎn)物，不利的加工和貯藏條件使其受到真菌污染的可能性大大增加。此外，ZEN極性較弱，極易從玉米胚芽遷移富集至玉米油中，造成玉米油被真菌污染，對其食用安全造成巨大隱患[13-14]。目前許多物理、化學(xué)和生物方法被用于減少、去除或破壞ZEN[15-17]。裴婭曉等[18]采用正交試驗得到脫除ZEN的最佳條件:堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.11%，超量堿用量為0.4%， 堿煉溫度為55 ℃，ZEN脫除率為94.63%。劉玉蘭等[19]采用吸附法對玉米油中ZEN的脫除進行了研究，WY1活性炭的效果最好，毛油中ZEN的含量從8 026.67 μg/kg降低至4 153.77 μg/kg，脫除率為48.25%。王月華等[20]以玉米胚芽為原料，研究了壓榨及毛油精煉過程對ZEN的影響，壓榨、堿煉和脫臭工藝對ZEN的脫除率分別達(dá)到了55.68%、44.00%、55.77%。由于ZEN是一種大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的化合物，在堿性條件下其內(nèi)酯鍵將部分打開[9,21]，因此，在采用化學(xué)方法時，受污染的糧食作物可通過ZEN與堿的化學(xué)作用降低其含量[22]。在油脂精煉過程中，堿煉脫酸是利用堿中和油脂中的游離脂肪酸，所生成的皂吸附部分其他雜質(zhì)而從油中沉降分離ZEN[23]。在堿煉過程中，整個系統(tǒng)處于堿性狀態(tài)，ZEN與堿反應(yīng)結(jié)合水洗能降低其毒性[24]。相比于其他方法，堿煉脫除ZEN不需要添加新的工藝程序及設(shè)備，能夠極大地降低生產(chǎn)成本，提高油脂的安全性能。

作者以加標(biāo)處理后受到ZEN污染的玉米毛油為研究對象，在實驗室條件下對其進行堿煉脫酸試驗，以ZEN脫除率為指標(biāo)，考察堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超量堿用量、堿煉初溫對 ZEN 脫除率的影響，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗，優(yōu)化玉米油堿煉脫酸工藝，最大程度降低玉米油中的ZEN含量，從而確定最有效的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米毛油(進行加標(biāo)處理)：山東三星集團，磷脂2.965 mg/g，酸值6.3 mg/g，過氧化值3.57 mmol/kg；ZEN標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；氫氧化鈉：分析純；乙腈、甲醇：色譜純；ZEN 免疫親和柱：北京康源泰博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY-220型電子分析天平：日本SHIMADZU公司；HH-4型數(shù)顯攪拌水浴鍋：常州丹瑞實驗儀器設(shè)備有限公司；L550臺式大容量離心機：湘儀離心機儀器有限公司；Cary Eclipse 熒光分光光度計：美國瓦里安公司；Agilent1260高效液相色譜儀(配有1260FLD檢測器)：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米赤霉烯酮的檢測方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將50 μg/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品溶液用色譜乙腈分別稀釋配制成質(zhì)量濃度為20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-20 ℃密封保存。

樣品的前處理方法參考GB 5009.209—2016《食品中玉米赤霉烯酮的測定》。

色譜條件：C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；預(yù)柱8 mm×12 mm，5 μm)流動相為乙腈和水(體積比為55∶45)；流速1 mL/min;柱溫25 ℃；進樣量20 μL；熒光檢測器。

1.3.2 玉米毛油水化脫膠

玉米毛油經(jīng)熱過濾后稱取一定量毛油于燒杯中，置于數(shù)顯式水浴鍋中加熱攪拌。采用中溫水化脫膠工藝，將毛油加熱至60～65 ℃后，加快攪拌速率，加入油質(zhì)量0.05%的磷酸反應(yīng)一定時間，除去非水化磷脂，之后加入磷脂含量3倍的水(與毛油溫度接近)，逐滴加入油中，保持該溫度和轉(zhuǎn)速攪拌0.5 h左右，隨后降低攪拌轉(zhuǎn)速使膠體集聚變大，待膠雜與油呈明顯分離狀態(tài)時停止攪拌，將樣品轉(zhuǎn)移至離心桶中，離心脫水干燥。

1.3.3 玉米毛油堿煉脫酸

根據(jù)玉米脫膠油的酸值，選擇中溫脫酸條件，將脫膠油加熱到初溫55 ℃，加快攪拌速率，根據(jù)酸值以及堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)將計量好的堿液加熱至溫度與油溫接近，緩慢加入油中反應(yīng)10 min后，升至堿煉終溫70 ℃，降低攪拌速率，至油皂明顯分離時停止攪拌。將油樣轉(zhuǎn)移至離心桶中以4 000 r/min離心20 min，上層凈油經(jīng)熱水洗滌至中性后于95 ℃真空減壓條件下脫水干燥。

1.3.4 玉米油酸值的測定

酸值的測定按照 GB 5009.229—2016 方法進行。

1.3.5 單因素試驗

采用1.3.3的方法對脫膠玉米油進行堿煉，通過單因素試驗，分別考察了堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超量堿用量、堿煉初溫對ZEN含量的影響，通過分析確定其每個因素的最優(yōu)條件。

1.3.6 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)玉米油堿煉單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。選擇堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)，超量堿用量(B)、堿煉初溫(C)作為優(yōu)化條件，以ZEN脫除率為評價指標(biāo)，建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化堿煉工藝。

1.3.7 ZEN脫除率計算公式

式中：M1為玉米脫膠油ZEN含量;M2為玉米脫酸油ZEN含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)溶液置于熒光分光光度計中，確定檢測波長為激發(fā)波長271 nm，發(fā)射波長462 nm。在此條件下，調(diào)節(jié)流動相比例和流速，最終確定流動相比例為V乙腈∶V水=55∶45，流速1 mL/min。

將配置好的一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行HPLC-FLD檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.013 4x+0.117 0，R2=0.999 9，該方法的ZEN檢出限為5 μg/kg，定量限為20 μg/kg，可以較為準(zhǔn)確、靈敏地測定ZEN的含量。

圖2 ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of ZEN

2.2 堿煉脫除ZEN的單因素試驗

玉米毛油經(jīng)水化脫膠得到的水化脫膠油酸值為6.2 mg/g，脫膠油的ZEN含量為6 816.52 μg/kg。

2.2.1 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ZEN含量的影響

反應(yīng)條件為反應(yīng)初始溫度55 ℃，終溫比初始溫度高15 ℃，超量堿用量為油脂質(zhì)量的0.2%，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、5%、8%、11%、14%，考察堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對ZEN含量的影響，結(jié)果如圖3所示。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖4、圖5同。圖3 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.3 Effect of alkali mass fraction on ZEN removal from corn oil

從圖3可以看出，隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，油脂中ZEN的含量先降低后增加，當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～5%時，由于堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，堿優(yōu)先與游離脂肪酸發(fā)生反應(yīng)形成皂膜，部分堿液被包裹在皂膜中，阻礙了堿液與ZEN的充分接觸反應(yīng)。而當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%～14%時，由于堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大，加入堿液的體積較少，從而容易形成局部堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，造成中性油的損失，以及有些區(qū)域堿液過少，堿液與ZEN的接觸面積不夠大，不利于ZEN與堿液的充分接觸以及脫除。而當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～8%時，由于堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，堿液在油脂中分散均勻，且被皂膜包裹的堿液由于內(nèi)外形成濃度差不斷擴散到皂膜外層，繼續(xù)與脂肪酸或者ZEN反應(yīng)，所以堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在此范圍內(nèi)對ZEN的脫除效果最好。當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時，脫酸油中殘留ZEN含量最低。因此，選最適宜的堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%。

2.2.2 超量堿用量對ZEN含量的影響

反應(yīng)條件為反應(yīng)初始溫度55 ℃，終溫比初始溫度高15 ℃，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，超量堿用量為油脂質(zhì)量的0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，考察超量堿用量對ZEN含量的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 超量堿用量對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.4 Effect of excess alkali content on ZEN removal from corn oil

從圖4可以看出，隨著超量堿用量的增加，油脂中ZEN含量先減少后趨于平穩(wěn)。這是由于添加的堿液越多，與ZEN接觸反應(yīng)的絕對堿量就越大。在超量堿用量達(dá)到0.2%時，油脂中殘留的ZEN含量遠(yuǎn)低于初始含量，脫除率達(dá)到98.47%，繼續(xù)添加超量堿用量，ZEN的脫除率沒有明顯變化，說明添加0.2%的超量堿已經(jīng)能夠使油脂中的ZEN與堿充分接觸反應(yīng)。由于超量堿用量過多會造成中性油的損失，影響油脂得率，所以選擇最適宜超量堿用量為油脂質(zhì)量的0.2%。

2.2.3 堿煉初溫對ZEN含量的影響

反應(yīng)條件為堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，超量堿用量為油脂質(zhì)量的0.2%，反應(yīng)初始溫度分別為35、45、55、65、75 ℃，堿煉終溫比初溫高15 ℃，考察堿煉初溫對ZEN含量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 堿煉初溫對油脂中ZEN脫除效果的影響Fig.5 Effect of alkali refining temperature on ZEN removal from corn oil

從圖5可以看出，油脂中ZEN含量在堿煉初溫為35～55 ℃均較低，增加堿煉溫度，油脂中ZEN的含量增加，其原因之一可能是油脂中游離脂肪酸的含量遠(yuǎn)大于ZEN的含量，游離脂肪酸比ZEN的酯更容易發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，隨著堿煉溫度的升高，可能更加有利于油脂中的游離脂肪酸與堿發(fā)生反應(yīng)，有利于皂腳的形成；另一個原因可能是隨著溫度的升高，ZEN在油脂中的溶解度增加，使得油脂中殘留的ZEN含量增加[25]。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化堿煉脫除ZEN工藝條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗。選擇堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、超量堿用量(B)、堿煉初溫(C)作為優(yōu)化條件，ZEN脫除率為指標(biāo)。因素與水平見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2.3.1 回歸模型建立及方差分析

采用Design-Expert 軟件，對表2的試驗結(jié)果進行方差分析，如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 方差分析 Table 3 Analysis of variance

注：**為極顯著(P<0.01)。

由表3可知，堿煉過程ZEN脫除率的二階模型回歸顯著(P<0.000 1)，失擬項不顯著(P=0.052 8)，并且該模型的R2=0.998 3，表明自變量與響應(yīng)值之間的模型關(guān)系顯著，該模型能夠解釋99.83%的響應(yīng)值變化，說明該回歸方程與實際情況擬合良好，可以用此模型來分析和預(yù)測堿煉過程的ZEN脫除率。從F值可知，3個因素對ZEN的脫除率影響為C>A>B，即堿煉初溫>堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)>超量堿用量。對模型各項進行方差分析可知，除了交互項AB對堿煉ZEN脫除率的影響不顯著外，模型中的一次項A、B、C，交互項AC、BC、A2、B2、C2對ZEN脫除率的影響均極顯著(P<0.01)。

2.3.2 響應(yīng)面分析

由圖6可知，當(dāng)超量堿用量一定時，ZEN的脫除率隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先增加后減少，當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，ZEN的脫除率隨著超量堿用量的增加先增加而后趨于穩(wěn)定，與單因素試驗的趨勢相同。由此可知，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超量堿用量的交互作用不明顯。

圖6 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超量堿用量的交互作用Fig.6 Interaction between alkali mass fractionand excess alkali content

由圖7可知，當(dāng)堿煉初溫一定時，隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，ZEN的脫除率先增加后降低，但是當(dāng)堿煉初溫較高時，ZEN的脫除率隨著堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加降低幅度加大。同樣地，當(dāng)堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，ZEN的脫除率隨著堿煉溫度的升高逐漸降低；堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同時，隨著堿液溫度變化，ZEN脫除率的變化率不同。由此可知，堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)和堿煉初溫存在交互作用。

圖7 堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)與堿煉初溫的交互作用Fig.7 Interaction between alkali mass fraction and initial temperature of alkali refining

圖8 超量堿用量與堿煉初溫的交互作用Fig.8 Interaction between excess alkali content and initial temperature of alkali refining

由圖8可知，當(dāng)堿煉初溫一定時，隨著超量堿用量的增加，ZEN的脫除率先增加后趨于平緩；當(dāng)超量堿用量一定時，隨著堿煉初溫的升高，ZEN脫除率先增加后減小，當(dāng)超量堿用量較低時，隨著堿煉初溫的升高，ZEN脫除率的減小幅度要大于超量堿用量較高時ZEN脫除率隨堿煉初溫升高而減小的幅度，因此超量堿用量與堿煉初溫存在交互作用。

2.4 最佳堿煉工藝及驗證

以油脂ZEN脫除率為響應(yīng)值，經(jīng)過回歸擬合，得到試驗因素對ZEN脫除率的回歸方程：

Y(%)=97.58-6.89A+4.30B-10.77C+0.15AB-2.69AC+3.33BC-6.59A2-4.61B2-6.14C2。

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化的方程得到最佳反應(yīng)條件為：堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.53%，超量堿用量為油脂質(zhì)量的0.22%，堿煉初溫38.83 ℃。驗證試驗將堿煉初溫修改為39 ℃，在此條件下，ZEN的脫除率為(99.15±0.08)%,與試驗預(yù)測結(jié)果誤差較小，表明響應(yīng)面優(yōu)化所得的堿煉脫酸工藝條件是可行的。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，在油脂堿煉脫除ZEN的工藝中，不同的堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超量堿用量、堿煉初溫對ZEN的脫除率均有顯著影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，建立了油脂堿煉脫除ZEN的數(shù)學(xué)模型，此模型能夠很好地預(yù)測ZEN在堿煉工藝中的脫除率。最佳工藝條件為：堿液質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.53%，超量堿用量0.22%，堿煉初溫39 ℃，在此條件下ZEN的脫除率為(99.15±0.08)%，證明該工藝條件能有效地脫除玉米毛油中的ZEN，提高油脂的安全性。