年糕殺菌工藝及其對年糕中微生物影響的研究

孫同輝，陳 潔*，許 飛，陳 玲

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640

年糕是一種歷史悠久的半方便性米制品，具有濃郁的地方特色[1]。年糕水分含量較高，且制作與貯藏過程中原輔料、半成品及成品都直接與水或空氣接觸[2]，很容易受到細菌、真菌污染發(fā)生變質(zhì)而失去食用價值，甚至引發(fā)食物中毒[3]，所以年糕普遍存在貨架期短等問題，從而影響這一傳統(tǒng)食品的工業(yè)化持續(xù)發(fā)展[4]。

傳統(tǒng)的年糕保鮮技術(shù)主要有高溫高壓滅菌和巴氏殺菌技術(shù)。經(jīng)高溫高壓滅菌的年糕雖然有較長的保質(zhì)期，但容易發(fā)硬和變黃，難以保持原有口感；經(jīng)巴氏殺菌的年糕，由于殺菌不徹底容易導(dǎo)致發(fā)霉變質(zhì)[5]。李共國等[6]研究了殺菌條件對年糕色澤、硬度和咀嚼度等的影響，殺菌溫度過高會產(chǎn)生褐變和硬度增大等現(xiàn)象；蔡懷依等[7]等研究了乙醇噴涂對年糕保鮮效果的影響，結(jié)果表明，乙醇噴涂可以控制年糕硬度增大和褐變，有效防止水分流失，雖然有較好的抑菌殺菌效果，但可能會影響年糕原有的米香味。

作者通過正交試驗對酸洗結(jié)合水浴處理的殺菌方式進行優(yōu)化，得到最優(yōu)殺菌工藝。同時采用傳統(tǒng)分離鑒定方法對年糕中微生物菌群進行分析，探究殺菌工藝對微生物菌群的影響，為年糕保鮮技術(shù)的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

糯米：中糧米業(yè)(五常)有限公司；粳米：中糧米業(yè)(巢湖)有限公司；高溫蒸煮袋：滄州華良包裝裝潢有限公司。

1.1.2 試劑

平板計數(shù)瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；乳酸、瓊脂粉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、無水乙醇：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑酚：北京索萊寶科技有限公司；2×Power Tap PCR Master Mix：天根生化科技(北京)有限公司；引物P0、P6、ITS1、ITS4：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MFD15多功能一步成型機：廣東衡聯(lián)食品機械有限公司；400型真空(充氣)包裝機：鄭州星火包裝機械有限公司；雙哈牌YX280型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器：上海三中醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TC-300 PCR儀：英國Techne公司；QL-866型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；5418 R 離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 年糕加工工藝流程

原料米(粳米、糯米)→淘洗→浸泡7 h→擠壓熟化→膠凝化→酸洗→瀝干→真空包裝→水浴滅菌。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 酸洗液體積分數(shù)對年糕品質(zhì)的影響

將凝膠化后的年糕用0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的乳酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數(shù)并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.2 酸洗時間對年糕品質(zhì)的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液分別沖洗1、5、10、20、30 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數(shù)并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.3 水浴溫度對年糕品質(zhì)的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，85、90、95、100 ℃水浴處理30 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數(shù)并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.2.4 水浴時間對年糕品質(zhì)的影響

將凝膠化后的年糕用1.0%的酸洗液沖洗5 min，瀝干表面水分，用高溫蒸煮袋真空包裝，95 ℃水浴處理20、30、40、50 min，37 ℃放置10 d，測定初始菌落總數(shù)并進行感官評價，每組試驗平行進行3次。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以初始菌落總數(shù)和感官評分為評價指標，選取酸洗液體積分數(shù)、酸洗時間、水浴溫度和水浴時間為考察因素，設(shè)計四因素三水平正交試驗，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.3.4 微生物總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016和GB 4789.15—2016測定微生物總數(shù)。

1.3.5 感官評價方法

由專業(yè)感官評定小組對年糕的色澤、彈性、口感、硬度和風(fēng)味等指標進行綜合評價，年糕感官評價標準見表2。

1.3.6 殺菌工藝對年糕微生物菌群的影響

1.3.6.1 年糕中微生物菌群提取

分別取3袋鮮樣期和殺菌后的年糕樣品，在無菌條件下各取25 g加入225 mL生理鹽水中，剪碎后用均質(zhì)器均質(zhì)2 min，取不同稀釋梯度的菌懸液，分別在平板計數(shù)瓊脂和孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，觀察、編號并記錄菌落形態(tài)，計算各菌種所占比例[8-9]。選取符合計數(shù)條件的平板，挑取不同菌落形態(tài)且占比較大的菌落進行反復(fù)劃線分離至菌落較純。在進行劃線提純時，細菌在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上36 ℃培養(yǎng)48 h；真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上28 ℃培養(yǎng)5 d。

表2 年糕感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria for rice cake

1.3.6.2 年糕中微生物菌群DNA提取

細菌和真菌DNA模板提取參考文獻[10]的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法。

1.3.6.3 基因擴增

以提取的DNA稀釋液為PCR擴增反應(yīng)的模板，以無菌雙蒸水為模板作陰性對照，利用25 μL反應(yīng)體系(正向引物、反向引物各1 μL，酶(2×Power Tap PCR Master Mix)12.5 μL，雙蒸水9.5 μL，模板DNA 1 μL)進行PCR擴增。真菌擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，72 ℃保持10 min，所用引物為ITS1和ITS4；細菌擴增程序：PCR循環(huán)中變性時間為1 min，退火時間為1 min，延伸時間為1.5 min，所用引物為P0和P6[9](P0∶5′-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′；P6∶5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC-3′)。

1.3.6.4 基因測序及序列分析

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，將結(jié)果與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast程序中已知的序列進行比對，獲取同源性較高的菌株的序列信息，并鑒定微生物種類。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 24 和 Origin 2017 進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酸洗液體積分數(shù)對年糕品質(zhì)的影響

如圖1所示，隨酸洗液體積分數(shù)的增加，年糕初始菌落總數(shù)呈逐漸遞減的趨勢，主要是因為隨著酸洗液體積分數(shù)的增加，酸洗液中H+濃度增加，酸洗相同時間時，年糕表面H+濃度逐漸升高，pH值越低，抑菌效果越好[11]。隨酸洗液體積分數(shù)的增加，年糕感官評分呈先上升后下降的趨勢，乳酸為食品酸味劑，在一定程度上可以改善食品風(fēng)味[12]，但酸洗液體積分數(shù)過大會導(dǎo)致年糕有明顯乳酸味道[13]，嚴重影響其風(fēng)味和口感。酸洗液體積分數(shù)為1.0%和2.0%時，感官評分較高，但酸洗液體積分數(shù)為1.0%時的抑菌效果較差，因此選定酸洗液體積分數(shù)為2.0%。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，圖2、圖3、圖4同。圖1 酸洗液體積分數(shù)對年糕初始菌落總數(shù)與感官評分的影響Fig.1 Effect of the volume fraction of pickling solution on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.1.2 酸洗時間對年糕品質(zhì)的影響

圖2 酸洗時間對年糕初始菌落總數(shù)與感官評分的影響Fig.2 Effect of pickling time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

如圖2所示，隨著酸洗時間延長，年糕初始菌落總數(shù)呈逐漸降低的趨勢，酸洗時間越長，可以使乳酸充分作用于年糕，增加年糕表面H+濃度，從而達到較好的抑菌效果。隨著酸洗時間延長，年糕感官評分呈先上升后下降的趨勢，大米淀粉在酸性條件下水解糊化形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可吸附水分子，具有一定的保水效果[14]，在合適的時間內(nèi)，會使年糕的口感風(fēng)味變好，但如果酸洗時間過長，會破壞年糕表面的凝膠膜狀態(tài)，令其粘連、爛糊[11]，導(dǎo)致年糕感官評分降低。綜合考慮，選定酸洗時間為20 min。

2.1.3 水浴溫度對年糕品質(zhì)的影響

熱殺菌是食品加工與保存中用于改善食品品質(zhì)、延長貯藏期最重要的處理方法之一[15]。如圖3所示，隨著水浴溫度升高，年糕體系中初始菌落總數(shù)呈逐漸下降趨勢，水浴時間相同時，水浴溫度越高，殺菌抑菌效果越好。隨著水浴溫度升高，年糕感官評分呈先升高后逐漸下降趨勢，水浴溫度越高，年糕褐變越嚴重[4]，硬度會隨著水浴溫度升高而增加，導(dǎo)致年糕口感變差，食用品質(zhì)降低。沈慶霞等[16]發(fā)現(xiàn)年糕直鏈淀粉含量隨著滅菌溫度的增加而有所升高，在淀粉高溫糊化后的冷卻凝膠過程中，淀粉分子通過氫鍵交聯(lián)聚合，直鏈淀粉含量越高，生成的氫鍵越多，使凝膠硬度增大，進而表現(xiàn)為年糕硬度增加，嚴重影響食用品質(zhì)，導(dǎo)致年糕感官評分降低。

圖3 水浴溫度對年糕初始菌落總數(shù)與感官評分的影響Fig.3 Effect of water-bath temperature on the total number of initial colonies and sensory scoreof rice cake

2.1.4 水浴時間對年糕品質(zhì)的影響

如圖4所示，隨著水浴時間的延長，初始菌落總數(shù)呈下降趨勢，相同水浴溫度時，水浴時間越長，年糕內(nèi)部熱傳遞效果越好，從而抑制微生物的生長繁殖，達到較好的抑菌殺菌效果。隨著水浴時間的延長，年糕感官評分先升高后逐漸降低。水浴時間越長，年糕色澤變黃、質(zhì)地變硬現(xiàn)象越明顯，同時會使年糕發(fā)生粘連和嚴重變形，還顯著影響其復(fù)水性能[17]，導(dǎo)致年糕在貯藏期內(nèi)食用品質(zhì)下降。

圖4 水浴時間對年糕初始菌落總數(shù)與感官評分的影響Fig.4 Effect of water-bath time on the total number of initial colonies and sensory score of rice cake

2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，各因素對初始菌落總數(shù)影響的主次順序為D>C>B>A，最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即酸洗液體積分數(shù)3.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min；各因素對感官評分影響的主次順序為A>C>B>D，最優(yōu)組合為A1B3C2D1，即為酸洗液體積分數(shù)2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間30 min。由表4可知，酸洗液體積分數(shù)、水浴溫度和水浴時間對初始菌落總數(shù)均有極顯著影響，酸洗時間有顯著影響；酸洗液體積分數(shù)對感官評分有極顯著影響，水浴時間對感官評分影響不顯著。綜合考慮，選定最優(yōu)方案為A1B3C2D2，即酸洗液體積分數(shù)2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min。采用優(yōu)化后的殺菌工藝進行3次驗證試驗，年糕常溫貨架期可達6個月，且品質(zhì)保持較好。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal design

2.3 殺菌工藝對年糕中微生物菌群的影響

將鮮樣期和殺菌后的年糕分組編號為①和②，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，年糕中細菌和真菌序列分析見表5、表6。通過累積柱狀圖對年糕中的微生物菌群相對豐度做進一步說明，結(jié)果見圖5、圖6。

由表5和圖5可知，在屬水平上，鮮樣期年糕中芽孢桿菌屬(Bacillus)所占比例最大，約為88.24%，其次為微球菌屬(Micrococcus)，所占比例為6.75%，產(chǎn)酸克雷伯桿菌(Klebsiellaoxytoca)占5.00%，其他菌屬占0.01%；殺菌后年糕中細菌腐敗菌種類迅速減少，以芽孢桿菌屬(Bacillus)為主，其他腐敗菌已被殺死或濃度低于檢出限，未被檢測到。綜上所述，此殺菌工藝可以有效抑制年糕中細菌的生長繁殖，達到較好的殺菌抑菌效果。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

注：*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

由表6和圖6可知，在屬水平上，鮮樣期年糕中的真菌菌屬分別是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)、籃狀菌屬(Talaromyces)，所占比例分別為63.63%、22.32%和14.03%。殺菌后年糕中青霉屬所占比例較大，約為82.34%，籃狀菌屬占17.66%，青霉屬廣泛分布于土壤、空氣、植物和室內(nèi)等環(huán)境中，能夠分泌具有高活性的蛋白質(zhì)、多糖和脂肪等大分子物質(zhì)的水解酶類[18-20]。此外青霉屬的適應(yīng)能力很強，對營養(yǎng)物質(zhì)、pH值和溫度變化的敏感性較弱，在食品加工過程中，其有性型籃狀菌亞屬的有性孢子比無性孢子的耐熱性和抗性均較強，不易被殺死[21]。

表5 年糕中細菌序列分析Table 5 Bacterial sequence analysis of rice cake

表6 年糕中真菌序列分析Table 6 Sequence analysis of fungi in rice cake

圖5 年糕中細菌菌種的相對豐度Fig.5 Relative abundances of bacterial strains in rice cake

圖6 年糕中真菌菌種的相對豐度Fig.6 Relative abundances of fungal strains in rice cake

3 結(jié)論

采用酸洗結(jié)合水浴處理的殺菌方式，以初始菌落總數(shù)和感官評分為評價指標，設(shè)計正交試驗對殺菌工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)殺菌工藝為酸洗液體積分數(shù)2.0%、酸洗時間15 min、水浴溫度95 ℃、水浴時間40 min。通過傳統(tǒng)分離鑒定方法對年糕中的微生物菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)鮮樣期年糕中細菌主要有芽孢桿菌屬、微球菌屬、產(chǎn)酸克雷伯桿菌及少量其他雜菌，真菌主要有青霉屬、曲霉屬和籃狀菌屬。殺菌后年糕中細菌主要是芽孢桿菌屬，真菌主要是青霉屬，殺菌后年糕貨架期可達6個月，殺菌工藝可以有效抑制年糕中微生物的生長繁殖，同時為進一步開發(fā)年糕保鮮措施提供依據(jù)。