人參莖葉總皂苷治療2 型糖尿病的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

洪佳娜李冰冰陳楨琳趙麟肖雪關(guān)永霞張貴民

（1.廣東藥科大學(xué)廣東省代謝病中西醫(yī)結(jié)合研究中心，廣東 廣州510006；2.廣東省代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006；3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂276000）

2 型糖尿?。═2DM）是由遺傳、精神、免疫、環(huán)境等多因素相互作用導(dǎo)致的以血糖持續(xù)升高為主要特征的代謝紊亂疾病，主要有多飲、多食、多尿及體重下降等臨床表現(xiàn)，持續(xù)的血糖升高還將導(dǎo)致多組織、多器官的慢性并發(fā)癥［1］。 據(jù)2018 年國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，全球糖尿病患者預(yù)計(jì)在2045年上升至6.93 億［2］。 2015 年，我國(guó)糖尿病患者總數(shù)達(dá)1.096 億，為糖尿病發(fā)生第一大國(guó)［3］。 現(xiàn)常用的糖尿病治療藥物包括胰島素及胰島素類似物、磺酰脲類與非磺酰脲類等胰島素促泌劑、噻唑烷二酮類等胰島素增敏劑、α-糖苷酶抑制劑、雙胍類、GLP-1受體激動(dòng)劑等［4］。 這些藥物能夠有效控制血糖及減少并發(fā)癥的發(fā)生，但長(zhǎng)期服用會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，如二甲雙胍常見的不良反應(yīng)為惡心、腹瀉、腹脹等消化道癥狀，降低了患者的生活質(zhì)量［5］。

人參莖葉為五加科植物人參Panax ginsengC.A. Mey.的干燥莖葉，主要成分為皂苷類成分［6］。 而人參傳統(tǒng)入藥部位為人參的干燥根及根莖，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，其具有“補(bǔ)五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣”的功效，其藥效基礎(chǔ)多為人參皂苷類成分。 研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉所含的人參皂苷成分與人參根莖所含的人參皂苷成分相近，且含量明顯高于人參根［7］。 人參莖葉總皂苷也是多個(gè)治療T2DM 中成藥如參芪降糖顆粒等的重要處方藥味。人參莖葉總皂苷成分具有改善糖脂代謝、抗炎、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、護(hù)心、改善記憶等功效［8-10］，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制等尚未完全明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)是通過(guò)構(gòu)建藥物、成分、靶點(diǎn)、疾病、通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)藥物的作用機(jī)制，適用于中藥復(fù)雜體系機(jī)制研究［11］。 本文擬就人參莖葉總皂苷治療T2DM 開展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，預(yù)測(cè)人參莖葉所含的皂苷類成分治療T2DM 的藥效基礎(chǔ)、潛在靶點(diǎn)以及作用通路，以期為人參莖葉總皂苷防治T2DM 的作用機(jī)制提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

使用軟件為Cytoscape3. 7. 1； 數(shù)據(jù)庫(kù)包括：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP）［12］（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，V2.3）；Pubchem（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）；SwissTargetPrediction［13］（http：／ ／www. swisstargetprediction. ch／index. php）；Uniprot（https：／ ／www. uniprot. org）；StringV11. 0［14］（https：／ ／string-db.org／）；Genecards （https：／ ／www.genecards. org／）； Scifinder （https：／ ／www. cas. org／products／scifinder）； DAVID 6. 8［15］（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）。

1.2 人參莖葉總皂苷成分庫(kù)的構(gòu)建

基于中國(guó)知網(wǎng)（http：／ ／www.cnki.net／）文獻(xiàn)檢索，結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出人參莖葉的皂苷類成分作為潛在藥效成分。 采用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)以及Scifinder 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索潛在藥效成分的Canonical SMILES 結(jié)構(gòu)式及CAS 號(hào)，并整理相關(guān)信息。

1.3 藥效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Swisstargetprediction 數(shù)據(jù)庫(kù)是基于2D 和3D 結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測(cè)化合物作用靶點(diǎn)的網(wǎng)站，將各潛在藥效成分的 SMILES 結(jié)構(gòu)式輸入搜索框， 設(shè)置“species”為“Homo sapiens”，進(jìn)行分子靶點(diǎn)對(duì)接，得到的靶點(diǎn)即為藥效成分靶點(diǎn)，用MS Excel 整理為“藥效成分-靶點(diǎn)”關(guān)系對(duì)，保存為.xlsx 格式。

1.4 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)，以2 型糖尿病英文名稱“type 2 diabetes”、“T2DM”及“diabetes mellitus type 2”為檢索詞，收集得到與T2DM 相關(guān)的疾病基因，即為疾病靶點(diǎn)基因。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范統(tǒng)一上述靶點(diǎn)命名，提取潛在藥效成分靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集，即為潛在治療靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置“species”為“homo sapiens”，得到潛在治療靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，導(dǎo)出為.tsv 格式，保留表格中的node1、node2 及combined score 等信息。 將“潛在藥效成分-靶點(diǎn)”關(guān)系對(duì)與潛在治療靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系利用Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建藥效成分治療T2DM 作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及潛在治療靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)利用“Network Analyzer”工具，對(duì)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，用節(jié)點(diǎn)大小反映degree 值大小，用邊的粗細(xì)反映combined score，將重要靶點(diǎn)及結(jié)合分?jǐn)?shù)可視化。

1.6 生物過(guò)程與通路分析

利用基因功能注釋在線分析工具DAVID 對(duì)篩選得到的人參莖葉總皂苷治療T2DM 的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)基因進(jìn)行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析及GO（gene ontology）功能富集分析，設(shè)置P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 人參莖葉總皂苷成分篩選

本研究共搜集得到45 種皂苷類成分（表1），這些成分主要為達(dá)瑪烷型原人參二醇型皂苷、達(dá)瑪烷型原人參二醇型皂苷、齊敦果酸類皂苷等成分。

表1 人參莖葉總皂苷成分表Table 1 Ginsenosides of Ginseng stems and leaves

表1 （續(xù)）

2.2 人參莖葉總皂苷成分-疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)SwissTargetPrediction 虛擬篩選得到成分靶點(diǎn)，刪除重復(fù)及假陽(yáng)性靶點(diǎn)，共得到成分靶點(diǎn)574個(gè)。 剔除無(wú)法查詢得到靶點(diǎn)的成分7 個(gè)，則共有待分析成分38 個(gè)。 由Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)共搜索得到與T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)10 321 個(gè)，以“relevance score”排序，選取排名前1 000 的基因作為待分析靶點(diǎn)進(jìn)行分析，將人參莖葉總皂苷成分靶點(diǎn)與待分析疾病靶點(diǎn)取交集得到活性成分靶點(diǎn)175 個(gè)。

2.3 人參莖葉總皂苷成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將38 個(gè)活性成分與175 個(gè)作用靶點(diǎn)導(dǎo)進(jìn)Cytoscape 3.7.1 軟件中，構(gòu)建“人參莖葉總皂苷成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，如圖1 所示。 圖1 顯示共有213 個(gè)節(jié)點(diǎn)，4 323 條邊，方形靶點(diǎn)代表人參莖葉總皂苷成分，圓形靶點(diǎn)代表人參莖葉總皂苷對(duì)應(yīng)的治療T2DM 的作用靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)間的相互作用。 其中，人參皂苷Rh3、人參皂苷F5、20（R）-原人參三醇為具有較多作用靶點(diǎn)的成分，在治療T2DM 的作用中可能發(fā)揮重要作用。 同時(shí)，靶點(diǎn)VEGFA（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、AKT1（絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶）、STAT3（信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）等靶點(diǎn)不僅與成分節(jié)點(diǎn)密切關(guān)聯(lián)，而且與靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)相互作用。 由此可見，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的作用是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

圖2 所示為潛在治療靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有175 個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 874 條邊。 對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)湫再|(zhì)分析，平均degree 值為32.846，平均Betweenness Centrality 為0.005 38，平均ClosenessCentrality 為0.527，以平均degree ＞32.846，平均Betweenness Centrality＞0.005 38，平均ClosenessCentrality＞0.527為篩選條件，篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，最終獲得關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)34個(gè)，具體信息見表2。

圖1 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Components-targets network

圖2 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Interaction network of targets

2.5 生物功能通路分析

將篩選得到的34 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)進(jìn)DAVID 在線分析平臺(tái)進(jìn)行GO 富集分析及KEGG 通路分析，用氣泡圖表示涉及靶點(diǎn)數(shù)目排名前15 的生物過(guò)程及通路，見圖3～圖6。 GO 富集分析包括生物過(guò)程分析（biological process，BP）、分子功能分析（molecular function，MF）以及細(xì)胞組分分析（cellular component，CC）。 由圖3 生物過(guò)程分析可見，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及的生物過(guò)程包括PI3K 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)（regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）、基因表達(dá)的正調(diào)控（positive regulation of gene expression）、信號(hào)傳導(dǎo)（signal transduction）等生物過(guò)程。 由圖4細(xì)胞組分分析可見，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要作用于細(xì)胞核（nucleus）、 細(xì) 胞 膜（plasma membrane）、 細(xì) 胞 質(zhì)（cytoplasm）、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（cytosol）等。 由圖5 分子功能分析可見，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、ATP 結(jié)合（ATP binding）、激酶活性（kinase activity）等分子功能。 圖6 KEGG 通路分析結(jié)果可見，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的作用關(guān)鍵靶點(diǎn)主要涉及癌癥通路（21 個(gè)靶點(diǎn)／61.8%）、黏附斑（14 個(gè)靶點(diǎn)／41.2%）、磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路（14 個(gè)靶點(diǎn)／41.2%）、ErbB 信號(hào)通路（13 個(gè)靶點(diǎn)／38.2%）、TNF 信號(hào)通路（13 個(gè)靶點(diǎn)／38.2%）等，體現(xiàn)了人參莖葉總皂苷多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用機(jī)制。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的生物過(guò)程富集分析Figure 3 Enriched gene ontology terms for biological process of key targets

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的細(xì)胞組分富集分析Figure 4 Enriched gene ontology terms for cellular component of key targets

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子功能富集分析Figure 5 Enriched gene ontology terms for molecular function of key targets

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis of key targets

3 討論

3.1 人參莖葉總皂苷關(guān)鍵成分與靶點(diǎn)探討

人參莖葉中的多種皂苷類成分調(diào)節(jié)血糖的作用已有研究證實(shí)，其機(jī)制主要與抗胰島細(xì)胞凋亡，改善胰島素抵抗與脂代謝相關(guān)。 人參皂苷Rb1 可增加胰島素敏感性，改善胰島素抵抗，同時(shí)可通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖的消耗，調(diào)節(jié)糖代謝紊亂［16］。 人參皂苷Rg1 可通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)以延緩糖尿病腎病的進(jìn)展［17］。 人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2、人參皂苷Rd 均具有抗T2DM 及其并發(fā)癥進(jìn)展的作用［18］。 本研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh3、人參皂苷F5、人參皂苷Rg4、20（R）-原人參三醇等作用于多個(gè)T2DM 靶點(diǎn)，提示這些成分具有防治T2DM，改善糖代謝紊亂的潛在價(jià)值。

通過(guò)對(duì)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析，發(fā)現(xiàn)AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF 等34 個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。AKT1 是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，能夠促進(jìn)胰島功能，增強(qiáng)其增殖及抗損傷的能力［19］。 MAPK 參與了細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等多種生理功能。TNF-α 可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，與胰島素抵抗密切相關(guān)［20］。 人參莖葉總皂苷可能通過(guò)以上各靶點(diǎn)間相互作用共同發(fā)揮對(duì)T2DM 的治療作用。

3.2 人參莖葉總皂苷信號(hào)通路探討

DAVID KEGG 通路分析結(jié)果顯示，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的通路主要涉及與炎癥免疫相關(guān)的通路3 條，分別為PI3K-Akt 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路；與細(xì)胞凋亡相關(guān)的通路1條，為ErbB 信號(hào)通路；與氧化應(yīng)激相關(guān)的通路1 條，為FoxO 信號(hào)通路。 與癌癥相關(guān)的通路3 條，分別為proteoglycans in cancer、pathway in cancer、prostate cancer；與生物過(guò)程相關(guān)的通路2 條，分別為黏附斑（Focal adhesion）信號(hào)通路、Osteoclast differentiation信號(hào)通路；與激素調(diào)節(jié)相關(guān)的通路2 條，為Estrogen信號(hào)通路與Prolactin 信號(hào)通路；與疾病相關(guān)的通路3 條，分別為Hepatitis B、Hepatitis C、Chagas disease（American trypanosomiasis）。

3.2.1 PI3K-Akt 信號(hào)通路PI3K-Akt 信號(hào)通路被認(rèn)為在胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子的代謝及有絲分裂活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 Akt 是PI3K 的主要下游分子，PI3k 的亞基PI3K-p85 對(duì)胰島素敏感性產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，而PI3K-p110 通過(guò)影響下游分子的活性，調(diào)節(jié)信號(hào)的連續(xù)傳導(dǎo)［21］。 下游分子AKT 的激活可促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖6-磷酸及糖原合成酶激酶3 進(jìn)一步調(diào)節(jié)糖酵解過(guò)程以及促進(jìn)糖原產(chǎn)生［22］，與胰島素抵抗相關(guān)的T2DM 關(guān)系密切。 有研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)小檗堿可以改善HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型的胰島素抵抗，其機(jī)制與激活胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中的PI3K／AKT 信號(hào)通路相關(guān)［23］。 除此之外，PI3K／AKT 信號(hào)通路還參與了細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)及分化，與胰島B 細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切。

3.2.2 Focal adhesion 信號(hào)通路Focal adhesion 具有機(jī)械結(jié)構(gòu)功能與信號(hào)傳遞功能。 Focal adhesion信號(hào)通路一向被認(rèn)為在細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用［24］。Luk 等［25］發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞中Focal adhesion 信號(hào)通路的關(guān)鍵酶-黏附斑激酶（FAK）會(huì)隨著胰島素抵抗及肥胖而增加，這表明脂肪細(xì)胞FAK 對(duì)代謝有重要作用。 同時(shí)，研究證實(shí)脂肪組織FAK 對(duì)于維持胰島素敏感及葡萄糖的穩(wěn)態(tài)是必須的。 蔣曦媛等［26］發(fā)現(xiàn)薏苡仁下調(diào)腎組織中FAK 及β1 整合素的表達(dá)，以減輕腎小球纖維化，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。 由此可見，F(xiàn)ocal adhesion 通路對(duì)于T2DM 及其并發(fā)癥均有重要作用。 本研究中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵基因不包括FAK，人參莖葉總皂苷可能并非直接作用于FAK 基因，而是作用于FAK 上游因子EGFR，從而激活FAK 以對(duì)T2DM 起治療作用。

3.2.3 ErbB 信號(hào)通路ErbB 信號(hào)通路具有保護(hù)心肌，抑制心肌纖維化與促進(jìn)血管新生的作用，主要與心肌細(xì)胞功能的正常發(fā)揮相關(guān)［27］。 有研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖正是通過(guò)介導(dǎo)NRG-1／ErbB 信號(hào)通路減少心肌細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善心功能［28］。 除此之外，鈣離子信號(hào)通路是ErbB 的重要下游信號(hào)通路，人參莖葉總皂苷可能通過(guò)作用于ErbB 信號(hào)通路中的靶點(diǎn)EGFR，關(guān)閉肌漿網(wǎng)膜上鈣離子通道防止出現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子過(guò)載，預(yù)防糖尿病性心臟病。 然而，又有研究表明通過(guò)阻斷EGFR 可以抑制腎臟免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和氧化應(yīng)激，增加胰島自噬活性等改善糖尿病腎病［29］。 所以，ErbB 信號(hào)通路的激活對(duì)于T2DM的發(fā)生發(fā)展可能是一把雙刃劍，有待于進(jìn)一步評(píng)估與研究。

3.2.4 癌癥相關(guān)通路與T2DM 密切相關(guān)值得關(guān)注的是，本研究發(fā)現(xiàn)人參莖葉總皂苷治療T2DM 的通路包括許多癌癥通路，如proteoglycans in cancer、pathway in cancer、prostate cancer 等。 有大型的流行病學(xué)調(diào)查［30］發(fā)現(xiàn)，T2DM 患者某些特定部位的癌癥發(fā)病率相較于非（2 型）糖尿病患者明顯升高，如胰腺癌的發(fā)病率增加2 ～3 倍，肝膽癌的風(fēng)險(xiǎn)提高兩倍，乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加20%等；除此之外，T2DM 患者的癌癥死亡率也較高。 其機(jī)制與糖尿病患者的高胰島素血癥對(duì)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的影響，有助于腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)。 胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子與胰島素受體結(jié)合進(jìn)一步激活mTORPI3K-AKT、Ras-Raf-MAPK 信號(hào)通路與Jak-Stat 通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲增加［31］。 臨床一線口服降糖藥二甲雙胍即被發(fā)現(xiàn)通過(guò)MAPK 途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)生長(zhǎng)抑制和DNA 損傷誘導(dǎo)基因153 的表達(dá)而具有抗癌潛力。 由此可見，人參莖葉總皂苷不僅對(duì)T2DM 具有治療作用，同時(shí)也具有抗癌潛力。

3.3 小結(jié)

綜上所述，人參莖葉總皂苷治療T2DM 的潛在有效成分可能是人參皂苷Rh3、人參皂苷Rb1、人參皂苷F5、20 （R） -原人參三醇等，這些成分可能通過(guò)對(duì)炎癥免疫、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、癌癥、激素調(diào)節(jié)等相關(guān)的信號(hào)通路，綜合作用于AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、TNF 等關(guān)鍵靶點(diǎn)，共同調(diào)節(jié)糖代謝紊亂，改善糖尿病以及糖尿病腎病、糖尿病心肌病、糖尿病血管病變等并發(fā)癥。