恒牙與乳牙牙髓干細胞增殖及唾液腺分泌相關(guān)分子基因表達比較

龐真貞 李碩 劉欽贊 李曄 王良

牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有多向分化的潛能，除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細胞外，經(jīng)過不同細胞因子的誘導(dǎo)，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細胞系類型[1,2]。牙髓干細胞有以下優(yōu)點，來源豐富，6～11歲自然脫落的牙齒中、成人需要拔掉的牙齒中均有豐富的牙髓干細胞[3,4]，因此無倫理爭議。本文分析乳牙與恒牙牙髓中唾液腺分泌相關(guān)分子水平，分析其是否具有治療唾液腺分泌功能低下的臨床價值。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1～12月的6～11歲脫落乳牙10顆與18～25歲因正畸拔除的完整磨牙10顆，牙齒健康，患者及家屬對治療方法知情同意，對本研究知情同意。排除標準：合并齲齒、根尖病、牙周病。試劑及儀器：20%胎牛血清，DMEM，細胞篩網(wǎng)。

1.2 干細胞純化擴增

1.2.1 牙髓干細胞：取上述刮牙周膜組織牙齒，切開牙冠，暴露牙髓，取出牙髓，浸入3倍雙抗PBS中，后續(xù)操作同上，待細胞匯合至80%，傳代。

1.2.2 細胞純化、擴增：分別收集培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的牙周膜細胞與牙髓細胞上清液，作為適應(yīng)性培養(yǎng)基；對培養(yǎng)細胞消化、離心、去上清，加適應(yīng)性培養(yǎng)基，吹打，過細胞篩，制成單個細胞超過懸液90%，調(diào)增細胞密度為每毫升10～15個，接種與96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h、48 h，標記單個細胞孔，補至每孔200 μl，第6天，半量換液，隨后每3天換1次。7～14 d，細胞數(shù)≥50為出現(xiàn)細胞克隆，待克隆細胞至孔底1/2～2/3后，用0.25%胰酶消化，離心，去上清，移至48孔培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)，至24孔、12孔、6孔，轉(zhuǎn)入6 cm、10 cm培養(yǎng)皿，獲取去量實驗用細胞。分別取第6代與第8帶牙髓干細胞進行分析。

1.3 第6代與第8代牙髓干細胞生長曲線 將細胞懸液調(diào)為密度1×104/ml，接種至96孔板，分為12組，每組6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)1～10 d，每天取1組，棄培養(yǎng)液，每孔加基礎(chǔ)培養(yǎng)基，5%CO2，37℃培養(yǎng)4 h，酶標儀492 nm處測A值，重復(fù)3次，取平均值，比較同一時間兩種細胞OD值。

1.4 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 制備細胞混懸液，密度為1×106/ml，分別裝入EP管中，標記，每組6個管，加入濃度為0.2 mg/ml的CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD146、CD166對應(yīng)的同型抗體濃度。4℃避光孵育50 min，PBS重懸，離心，棄上清，加PBS重懸，過濾，流式細胞儀測定分析。

1.5 唾液腺分泌相關(guān)分子表達 提取牙髓干細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qPCR方法檢測，檢測相關(guān)分子基因序列參考文獻[1]。檢測相關(guān)分子包括MR1(毒蕈堿型乙酰膽堿受體1)，MR3(毒蕈堿型乙酰膽堿受體3)，APQ5(水通道蛋白5)，β1-AR(β1-腎上腺素受體)，β2-AR(β2-腎上腺素受體)，α-淀粉酶，黏蛋白5B。

2 結(jié)果

2.1 第6代與第8代牙髓干細胞增殖比較 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均在第9天達到平臺期。見表1。

類別1d2d3d4d5d6d7d8d9d10d第6代乳牙0.23±0.080.26±0.080.50±0.100.69±0.121.02±0.231.41±0.321.55±0.411.61±0.441.73±0.481.75±0.51第8代乳牙0.24±0.080.28±0.090.53±0.110.70±0.211.05±0.321.42±0.331.60±0.461.63±0.421.75±0.501.77±0.53第6代恒牙0.23±0.090.30±0.100.55±0.160.73±0.221.04±0.331.42±0.361.62±0.511.62±0.441.78±0.551.83±0.60第8代恒牙0.25±0.080.29±0.090.56±0.170.72±0.211.06±0.351.44±0.451.61±0.501.65±0.461.72±0.561.79±0.55F值0.0810.2150.2190.0530.0180.0070.0260.0150.0150.023P值0.9700.8850.8820.9830.9970.9990.9940.9970.9970.995

2.2 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙牙髓干細胞標志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

類別CD44CD29CD90CD73CD146CD105第6代乳牙99.52±1.4899.32±1.5799.44±1.6297.43±1.4596.23±1.9497.99±1.48第8代乳牙99.34±1.3699.31±1.6499.80±1.0397.66±1.5296.34±1.6398.04±1.50第6代恒牙99.32±1.5299.35±1.5999.84±1.0698.01±1.6095.98±1.7198.31±1.16第8代恒牙99.63±1.4499.41±1.6299.40±1.1398.15±1.5496.49±1.6898.42±1.25F值0.0640.0060.2100.2760.2160.141P值0.9780.9990.8880.8420.8840.934

2.3 第6代與第8代牙髓干細胞唾液腺分泌相關(guān)分子基因表達 MR1在第6代恒牙牙髓干細胞中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙與第8代恒牙表達水平相當。MR3在4組中的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6帶恒牙中的表達水平相似，顯著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表達水平最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表達水平最高，其次為第6代恒牙，第8代乳牙表達水平最低，顯著低于其他3組(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第8代恒牙，顯著高于第6代乳牙與第8代恒牙，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表達水平最低，4組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

類別MR1MR3AQP5β1-ARβ2-ARα-淀粉酶黏蛋白5B第6代乳牙1.05±0.310.13±0.061.05±0.310.93±0.200.95±0.330.98±0.320.97±0.30第8代乳牙0.68±0.210.10±0.031.09±0.320.89±0.220.25±0.070.81±0.350.80±0.26第6代恒牙2.94±0.550.12±0.051.06±0.292.81±0.640.84±0.281.94±0.412.62±0.48第8代恒牙0.62±0.180.09±0.030.31±0.080.78±0.520.64±0.221.62±0.400.40±0.11F值60.5661.01311.91129.6159.46312.28057.371P值0.0000.4080.0000.0000.0000.0000.000

3 討論

3.1 干細胞分析 干細胞(stem cells)是一類具有自我更新、自我復(fù)制能力的多潛能細胞[5]。在一定條件下，它可以分化成多種APSC多能細胞，是一類具有自我復(fù)制和多向分化潛能的原始細胞。多能干細胞(Ps)具有分化出多種細胞組織的潛能，但失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制[6]。

3.2 牙髓干細胞 牙髓干細胞無論從數(shù)量上，還是分離培養(yǎng)方法上，均具有成為該細胞庫的潛能[7]。牙髓屬于結(jié)締組織，有一定的修復(fù)再生能力，因成牙本質(zhì)細胞屬于終末細胞，一旦分化，就不再分裂，因此，一般認為牙本質(zhì)細胞受損后，牙髓內(nèi)未分化前提細胞能分化為成牙本質(zhì)細胞[8,9]。目前認為牙髓干細胞可能來自血管周圍微環(huán)境。牙髓干細胞體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其具有高度增生能力與自我更新能力[10,11]。在本次研究中，第6代乳牙、第8代乳牙、第6代恒牙、第8代恒牙增殖趨勢相似，在第9天進入平臺期，并且干細胞標記物表達水平?jīng)]有顯著差異，這提示不同代次的乳牙與恒牙牙髓干細胞一般生物學(xué)特性詳細。

3.3 牙髓干細胞唾液腺分泌相關(guān)分子基因表達 唾液腺分泌受腺上皮細胞表達的MR與AR調(diào)控，MR激活可調(diào)節(jié)AQP5，調(diào)節(jié)水的快速轉(zhuǎn)運。MR、AQP5可衡量唾液腺水分泌功能。α淀粉酶、黏蛋白是唾液中重要的蛋白質(zhì)，其分泌受β-AR調(diào)控[12]。對不同代次乳牙與恒牙牙髓干細胞中唾液腺分泌相關(guān)分子的基因表達水平進行分析，結(jié)果顯示MR1在第6代恒牙牙髓干細胞中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙與第8代恒牙表達水平相當。MR3在4組中的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AQP5在第6代乳牙、第8代乳牙、第6帶恒牙中的表達水平相似，顯著高于第8代恒牙(P<0.05)。β1-AR在第6代恒牙中的表達水平最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。β2-AR在第6代乳牙中的表達水平最高，其次為第6代恒牙，第8代乳牙表達水平最低，顯著低于其他3組(P<0.05)。α-淀粉酶在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第8代恒牙，顯著高于第6代乳牙與第8代恒牙，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。黏蛋白5B在第6代恒牙中表達水平最高，其次為第6代乳牙，第8代乳牙，第8代恒牙的表達水平最低，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這結(jié)果提示第6代乳牙、第8代乳牙以及第6代恒牙、第8代恒牙均有不同水平的唾液腺分泌相關(guān)分子基因表達，雖然第6代恒牙在MR1、β1-AR、α-淀粉酶、黏蛋白5B表達水平更高一些，但第6代乳牙相關(guān)基因的表達也相對穩(wěn)定，并且乳牙牙髓干細胞相對于恒牙，更容易獲得。

3.4 第6代與第8代牙髓干細胞標志物測定 CD44、CD29、CD90、CD73、CD146、CD105是牙髓干細胞的常見標志物，可在牙髓干細胞中完全表達，可在一定程度上對口腔疾病進行有效判斷。本研究顯示，恒牙與乳牙牙髓干細胞生長情況與干細胞標記物相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，恒牙與乳牙牙髓干細胞生長情況與干細胞標記物沒有顯著差異。第6代與第8代乳牙及恒

牙表達不同水平的唾液腺分泌相關(guān)分子基因，為唾液腺功能低下的治療提供了新的可能，并且乳牙牙髓干細胞更容易獲得，有望成為理想的組織工程種子細胞。