依替福辛對術后認知功能障礙小鼠的認知保護作用及機制

馬麗 張暉 郭文治 郭航 馬亞群

1 材料與方法

1.1 實驗材料 依替福辛(美國sigma)；非那司提(finasteride，FIN)(中國TCI)；兔抗TSPO抗體(美國abcam)；小鼠β-actin抗體(美國abcam)；小鼠四氫孕酮 ELISA試劑盒(美國Arbor Assays)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D)；IL-1β ELISA試劑盒(美國RD)；PVDF膜、蛋白上樣緩沖液等(武漢Servicebio)。

1.2 實驗動物及POCD模型制作 C57老年小鼠(20月齡)，雄性，清潔級，斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2015-0015。POCD模型制作過程：無菌環(huán)境中，小鼠麻醉后于腹部做中線切口，長約2 cm，結扎血管，行肝葉切除術。逐層關腹，術后保暖。

1.3 動物分組與處理 小鼠隨機分為對照組(Control組)、POCD組、POCD+EFX組、POCD+EFX+FIN組，每組24只。將所有實驗小鼠水迷宮中進行連續(xù)4 d的隱蔽平臺訓練實驗。POCD + EFX組進行水迷宮訓練前先進行3 d的依替福辛(50 mg/kg，溶劑為1%吐溫80+0.9%氯化鈉溶液)腹腔注射；POCD+EFX+FIN組進行水迷宮訓練前先注射3 d的依替福辛(50 mg/kg)和非那司提(5 mg/kg，溶劑為30%羥丙基-beta-環(huán)糊精+0.9%氯化鈉溶液)。4 d的隱蔽平臺試驗訓練完成后POCD組、EFX組、POCD+EFX+FIN組進行肝葉切除術。分別在術后第3天和第7天進行水迷宮探索實驗。

1.4 Morris水迷宮

1.4.1 Morris水迷宮是一種經典的用于檢測實驗動物空間學習記憶能力的方法。先進行連續(xù)4 d的隱蔽平臺試驗訓練。實驗前1 d，讓動物在不含平臺的水池中自由游泳90 s，上午、下午各1次，使其熟悉迷宮環(huán)境。實驗時平臺位置固定不變，置于東北象限中央，平臺中點離池壁22.5 cm。在平臺對側選兩個與之距離相等的點作為入水點，訓練時將動物面朝池壁輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的游泳路線的長度及找到平臺的時間(逃避潛伏期)，然后讓小鼠在平臺上停留10 s。如果90 s內找不到平臺，潛伏期記為90 s，并將小鼠置于平臺上休息10 s。每天在2個入水點各訓練1次，以2次潛伏期均值作為該天的成績。

1.4.2 訓練結束后次日進行手術。手術后在第3天、第7天進行空間探索實驗。撤除平臺，然后任選一相同入水點將小鼠放入水中，記錄小鼠在60 s內游泳路徑，對小鼠在原平臺象限的停留時間、游泳距離百分數及穿越平臺的次數進行統(tǒng)計分析。

1.5 標本采集、處理 術后第3、7天，完成空間探索實驗的小鼠，每組12只，斷頭處死，迅速取出腦組織，用4℃ 0.9%氯化鈉溶液洗去血污，濾紙吸干。在冰上分離小鼠雙側海馬組織置于-80℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 統(tǒng)計學分析 應用Prism統(tǒng)計軟件，對Morris水迷宮所得到的逃避潛伏期數據使用重復測量方差分析，組間比較采用正態(tài)分布和方差齊性檢驗后選擇單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Bonferroni-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Morris水迷宮結果 隱蔽平臺試驗訓練的結果顯示在4 d的訓練過程中，4組小鼠尋找隱蔽平臺的潛伏期、路程均呈現隨時間逐漸縮短趨勢，但組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4組小鼠游泳速度各組間差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后第3天空間探索實驗結果顯示，無論是在目標象限時間百分數還是在目標象限路程百分數組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=6.349,P=0.0012；F=6.670,P=0.0009)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示：與Control組比較，POCD組小鼠在目標象限停留時間和游泳距離明顯縮短(P<0.01)；與POCD組相比，POCD+EFX組小鼠在目標象限停留時間和游泳距離明顯延長(P<0.05)；使用非那司提拮抗后，小鼠在目標象限游泳距離再次縮短(P<0.05)，但在目標象限停留時間與POCD+EFX組雖有縮短趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后7 d時空間探索實驗顯示4組小鼠在目標象限時間百分數、目標象限路程百分數及穿越平臺次數差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別目標象限時間百分數(%)目標象限路程百分數(%)平臺穿過次數(次)Control組 41.19±6.7341.89±6.482.27±1.56POCD組 28.00±8.11?29.56±9.31?1.45±1.13POCD+EFX組 38.48±9.28#39.70±8.33#2.00±1.10POCD+EFX+FIN組29.75±9.7329.61±9.38△1.33±1.10

注:與Control組比較，*P<0.01； 與POCD組比較，#P<0.05；與POCD+EFX組比較，△P<0.05

2.2 海馬TSPO的表達 術后3 d海馬TSPO蛋白水平組間差異有統(tǒng)計學意義(F=10.10,P=0.0043)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示：與Control組比較，POCD組小鼠海馬水平顯著升高(P<0.05)；與POCD組比較，POCD+EFX組小鼠TSPO蛋白水平與POCD組相比顯著降低(P<0.01)；使用非那司提拮抗依替福辛作用后，TSPO蛋白水平雖然有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.3 炎性因子的表達 術后3 d 4組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β細胞因子水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=6.941,P=0.0058；F=16.00,P=0.0002)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示：與Control組比較，POCD組小鼠TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P<0.05;P<0.01)；與POCD組比較，依替福辛預處理可顯著降低TNF-α、IL-1β水平(P<0.05)；使用非那司提拮抗后，IL-1β水平顯著升高(P<0.05)，TNF-α蛋白水平雖有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

組別TNF-αIL-1βControl組 11.71±2.675.98±2.00POCD組 20.28±3.82?16.90±4.16#POCD+EFX組 12.17±3.00△9.14±2.30☆POCD+EFX+FIN組20.16±4.6918.79±3.31▲

注:與Control組比較，*P<0.05，#P<0.01； 與POCD組比較，△P<0.05,☆P<0.01；與POCD+EFX組比較，▲P<0.01

2.4 四氫孕酮含量 術后第3天4組小鼠海馬組織中四氫孕酮含量比較差異有統(tǒng)計學意義(F=8.968,P=0.0022)。Bonferroni-t檢驗進一步兩兩比較顯示：與Control組比較，POCD組小鼠海馬內四氫孕酮含量顯著降低(P<0.05)；POCD模型小鼠接受依替福辛預處理后，海馬四氫孕酮含量顯著升高(P<0.01)；而使用四氫孕酮合成抑制劑非那司提拮抗后，海馬四氫孕酮含量較POCD+EFX組又顯著降低(P<0.05)。見表3。

組別四氫孕酮含量Control組0.64±0.09POCD組0.38±0.04?POCD+EFX組0.66±0.13#POCD+EFX+FIN組0.44±0.09△F值8.968P值<0.01

注:與Control組比較，*P<0.05； 與POCD組比較，#P<0.01；與POCD+EFX組比較，△P<0.01

3 討論

POCD的發(fā)生與腦內炎癥關系密切，我們的實驗結果也提示POCD模型小鼠認知功能較Control組顯著降低，腦內炎性因子TNF-α、IL-1β表達顯著增加。此外，本實驗結果還顯示POCD小鼠腦內TSPO蛋白表達也顯著增加。已知正常健康的大腦TSPO表達量較低，TSPO表達量上調目前普遍被認為是小膠質細胞激活的標志。在多發(fā)性硬化患者[5]、脊髓側索硬化癥[6]、阿茲海默癥[7,8]等慢性神經退行性疾病中，TSPO放射性配體的結合率都明顯增加，且與組織病理染色中的小膠質細胞激活程度一致，與疾病的嚴重程度也有很強的相關性。因此雖然關于POCD模型動物腦內TSPO如何變化，目前并未見相關報道，但可以推斷POCD腦內炎癥的增加伴隨著小膠質細胞的激活，同時必然存在TSPO表達水平的顯著升高。本研究結果證實了此推斷。

在我們的實驗中，依替福辛可顯著增加腦內四氫孕酮的含量，非那司提作為四氫孕酮的合成抑制劑部分拮抗了依替福辛的作用，不僅降低了四氫孕酮的含量，還使得海馬認知能力又有所降低，炎性因子TNF-α、IL-1β表達顯著增降低。這提示依替福辛對POCD動物模型的保護作用可能與其增加了四氫孕酮的合成有關。Daugherty等[17]在多發(fā)硬化癥模型中發(fā)現依替福辛的神經保護作用可能與3α-HSD的mRNA表達增加繼而增加四氫孕酮的含量有關，其中3α-HSD是四氫孕酮合成的重要反應酶。雖然目前認為依替福辛與TSPO蛋白結合力較低，但其在結合部位的結合實踐較長可以解釋其合成甾體類激素的的高效性[20]。既往大量實驗表明作為一種重要的甾體類激素，四氫孕酮具有顯著的神經保護效應[21]。其中，四氫孕酮是如今明確的唯一一種既能刺激腦神經前體細胞增生又能緩解阿茲海默癥病理過程的化學物質，以至于目前它被認為是治療阿茲海默癥的潛在性藥物[22]。在LPS損傷模型[23]的實驗研究中，外源性四氫孕酮的攝入也可產生一定的抗神經炎癥及神經保護作用。但目前尚未見到使用四氫孕酮進行POCD預防及治療的研究。

本研究也有一定的局限性，由于在水迷宮空間探索實驗中，4組間小鼠行為學表現僅在術后第3天差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在術后第7天差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，因此我們僅進行了術后第3天的實驗室檢測。而根據文獻，炎性因子的變化可能持續(xù)至術后第7天及以后，本實驗不能明確依替福辛抗炎作用的持續(xù)時間。非那司提僅表現出部分拮抗作用，可能是因為樣本量不夠，或者依替福辛的神經保護作用涉及多途徑。此外，我們雖然檢測了TSPO腦內水平的變化，但沒有測定TSPO親和力及功能變化。

綜上所述，依替福辛作為TSPO配體在POCD動物模型中可顯著減輕炎性反應，改善認知功能，而這種神經保護作用可能與其增加四氫孕酮的含量有關。由于依替福辛是臨床已經使用的藥物，加上其本身并不會對健康老年人的認知及覺醒有任何損害[24]，因此具有良好的臨床應用前景。