共表達(dá)谷氨酰-tRNA還原酶增強(qiáng)染料脫色過氧化物酶在大腸桿菌中的表達(dá)活性

顧鵬帥，潘梅，丁亮亮，唐蕾,2*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

過氧化物酶是一類重要的氧化還原酶，能利用過氧化氫催化一系列有機(jī)物和無機(jī)物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，在生物合成、降解等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用[1-3]。大多數(shù)過氧化物酶含有血紅素，這些血紅素過氧化物酶一般分為兩個(gè)超家族，動(dòng)物和植物過氧化物酶[4]。最近發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的血紅素過氧化物酶家族，并被歸類為染料脫色過氧化物酶型(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)家族[5]。這種酶類能降解蒽醌類染料以及木質(zhì)素等頑固性化合物，可利用生物法實(shí)現(xiàn)對(duì)染料廢水以及木質(zhì)素廢棄物的處理[6]，因此在紡織、造紙、環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用潛力[7]。

在自然界中，生物體有兩條途徑可對(duì)血紅素進(jìn)行合成，即C4和C5途徑[8]。以往對(duì)血紅素蛋白的研究表明，血紅素輔助因子的充足供應(yīng)對(duì)于血紅素蛋白可溶性表達(dá)及活性有重要作用[9]。對(duì)于提高大腸桿菌胞內(nèi)血紅素的積累已有較多報(bào)道，根據(jù)其相關(guān)機(jī)制分為兩種策略。第一種策略通過外源添加血紅素前體物質(zhì)，來增強(qiáng)胞內(nèi)血紅素的合成，最終實(shí)現(xiàn)血紅素的累積。例如，陳丹園等[10]在培養(yǎng)基中添加FeCl2、谷氨酸(Glu)、5-氨基乙酰丙酸、葡萄糖(Glc)對(duì)血紅素積累有一定的促進(jìn)作用，使得實(shí)驗(yàn)組血紅素產(chǎn)量相對(duì)對(duì)照組血紅素產(chǎn)量大幅度提高。第二種策略是通過過表達(dá)血紅素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因來實(shí)現(xiàn)血紅素的累積。例如PRANAWIDJAJA等[11]將來自球形紅細(xì)菌的5-氨基乙酰丙酸合成酶基因(ALAS)和大腸桿菌自身基因組的泛酸激酶基因(coaA)導(dǎo)入大腸桿菌，通過C4途徑促進(jìn)了大腸桿菌胞內(nèi)血紅素的積累。這些研究為解析大腸桿菌血紅素合成途徑調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)，證實(shí)了通過外源添加血紅素前體物質(zhì)以及過表達(dá)血紅素合成相關(guān)途徑的基因可提高大腸桿菌胞內(nèi)血紅素的含量，但未對(duì)血紅素與過氧化物酶的功能關(guān)系作出進(jìn)一步探討。

大腸桿菌利用C5途徑合成血紅素。在這種生物合成途徑中，谷氨酸五碳骨架首先經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化，變?yōu)楣劝滨?tRNA，并以此作為前體物質(zhì)流向下游代謝途徑，最后經(jīng)亞鐵鰲合酶鰲合胞內(nèi)鐵離子形成血紅素。其中，谷氨酰-tRNA經(jīng)hemA編碼的谷氨酰-tRNA還原酶催化生成谷氨酰-1-半醛，被認(rèn)為是血紅素合成限速步驟之一[12]。本研究將來自大腸桿菌的hemA與嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)的DyP過氧化物酶基因(TfuDyP)共表達(dá)，在提高細(xì)胞內(nèi)血紅素含量的同時(shí)，進(jìn)一步增強(qiáng)TfuDyP活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中使用的質(zhì)粒與菌株如表1所示。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.1.2 酶和試劑

引物，由天霖生物科技有限公司(上海)合成；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ 和XhoⅠ，Takara 公司；CloneExpressRⅡ One Step Cloning Kit試劑盒，諾唯贊生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、草酸，Sigma公司；活性藍(lán)19(Reactive Blue 19，RB19)，上海源葉生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、硫酸卡那霉素(Kan)，上海生工。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1hemA和TfuDyP基因的克隆

hemA基因參考NCBI上公布序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946981.2)。TfuDyP基因來源于實(shí)驗(yàn)室保藏質(zhì)粒pDyP。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用pDyP質(zhì)粒作為模板，利用上游引物5′-AAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTAATACGACTCACTAT-AGGGGA-3′和下游引物5′-GTGGTGGTGGTGGTGCT-CGAGTTAACCTTCAATCAGATCCTGACCC-3′擴(kuò)增得到TfuDyP基因。用XhoI單酶切phemA質(zhì)粒載體，膠回收后通過同源重組酶在37 ℃中連接30 min，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞。篩選陽性重組子，送天霖生物科技有限公司(上海)測(cè)序。質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。

圖1 重組質(zhì)粒phemA-DyP示意圖Fig.1 Schematic representation of recombinant plasmid phemA-DyP

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化鑒定

重組菌于37 ℃，200 r/min過夜活化培養(yǎng)后，按4%接種量轉(zhuǎn)接至含50 μg/mL Kan抗生素的LB液體培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)中所需的谷氨酸、FeCl2經(jīng)無菌水溶解過濾除菌后分別按40、20 μmol/L含量與活化重組菌一同加入LB液體培養(yǎng)基中。待菌體的OD值為0.6～0.8 時(shí)，加入終濃度0.3 mmol/L IPTG，37 ℃條件誘導(dǎo)8 h。用磷酸緩沖液(20 mmol/L， pH=7.4)懸浮菌體，超聲破碎細(xì)胞20 min，4 ℃，10 000 r/min離心30 min。粗酶液用 0.45 μm過濾膜進(jìn)行過濾，以除去雜質(zhì)。用含有20 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液進(jìn)行平衡后上樣，最后用含有500 mmol/L咪唑的磷酸緩沖液進(jìn)行線性洗脫。根據(jù)洗脫圖譜，收集對(duì)應(yīng)洗脫峰的酶液。純化后的蛋白用12%的SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.2.4 血紅素濃度測(cè)定

利用熒光法來檢測(cè)血紅素濃度,參考陳丹園[10]胞內(nèi)血紅素檢測(cè)方法。

1.2.5 TfuDyP的光譜分析

DyP在408 nm 處有一個(gè)明顯的亞鐵血紅素酶的特征吸收峰[13-15]，因此可以通過光譜分析TfuDyP與血紅素結(jié)合度。取200 μL純酶樣品，運(yùn)用多功能酶標(biāo)儀biotek在280～700 nm對(duì)其進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

1.2.6 TfuDyP的活性檢測(cè)

以ABTS為底物，檢測(cè)TfuDyP過氧化物酶的活性[16-17]。反應(yīng)體系包括20 mmol/L的醋酸緩沖液、終濃度0.2 mmol/L的ABTS、適量稀釋后的100 μL純酶液，終濃度0.2 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30 s，終止劑為200 μl、2%SDS。使用紫外可見分光光度計(jì)儀檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物在420 nm(ε= 36 000 mol/cm)-1)的光吸收值。一個(gè)酶活力單位定義為：在25 ℃、pH 4.5條件下，氧化1 μmol ABTS所需要的酶量。比酶活(U/mg)= 酶活(U/mL) ÷蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.7 TfuDyP對(duì)不同染料的脫色測(cè)定

以活性藍(lán)(RB19)、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)為研究對(duì)象，反應(yīng)體系包括20 mmol/L的醋酸緩沖液、終濃度0.1 mmol/L的染料溶液、適量稀釋后的100 μL純酶液，終濃度0.2 mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，終止劑為200 μL、2%SDS。在25 ℃、pH 4.5條件下，反應(yīng)15 min后檢測(cè)溶液在最大吸收波長(zhǎng)的光吸收值，記為A,脫色率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為對(duì)照組光吸收值。

2 結(jié)果與分析

2.1 共表達(dá)菌株構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保存的pDyP質(zhì)粒為模板，使用特異性引物PCR擴(kuò)增獲取目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示與預(yù)期大小1 543 bp相符(圖2-a)。通過同源重組酶連接到phemA質(zhì)粒上，組成新的重組質(zhì)粒phemA-DyP，用XhoI酶切并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證(圖2-b)，phemA質(zhì)粒約為6 558 bp，大小相符，進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證，確保無誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M-DNA marker；a-1為目的基因TfuDyP擴(kuò)增；b-1為重組質(zhì)粒phemA-DyP酶切驗(yàn)證圖2 目的基因和重組質(zhì)粒構(gòu)建的凝膠電泳Fig.2 Gel electrophoresis for target gene and recombinant plasmid

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化鑒定

將新構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得具有活性的可溶性TfuDyP，TfuDyP粗酶液經(jīng)鎳柱純化和脫鹽柱脫鹽處理后，利用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)重組蛋白純度。如圖3所示，酶純度已到達(dá)了酶學(xué)性質(zhì)分析的要求，融合蛋白理論大小約為47.4 kDa，與目的條帶在電泳圖中的位置吻合。

M-蛋白Marker;1-純化的TfuDyP圖3 TfuDyP的SDS-PAGE電泳分析Fig.3 The SDS-PAGE electrophoresis for recombinant TfuDyP expression

2.3 重組菌的血紅素濃度檢測(cè)

將重組菌在37 ℃、0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行胞內(nèi)血紅素檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，pD菌株血紅素濃度為3.4 μmol/L，而共表達(dá)菌株pAD血紅素濃度明顯提高，達(dá)到9.8 μmol/L，在菌株pAD培養(yǎng)基中外源添加20 μmol/L FeCl2(下同)、40 μmol/L谷氨酸(下同)血紅素濃度進(jìn)一步提高到11.3 μmol/L、13.5 μmol/L。誘導(dǎo)后的共表達(dá)菌株菌體棕紅色加深，這可能是由于胞內(nèi)血紅素的積累所致。

圖4 重組菌的血紅素含量Fig.4 Contents of heme for recombinant strains

2.4 TfuDyP的光譜吸收

純化后的TfuDyP溶液呈棕紅色，進(jìn)一步表明酶的活性位點(diǎn)存在著亞鐵血紅素基團(tuán)[3]。DyP的血紅素和蛋白質(zhì)含量通過408 nm處(Soret峰值)和280 nm表示。Soret峰值為血紅素的特征吸收峰[19]，可用來表征血紅素?fù)饺隩fuDyP中的水平。除包含空載質(zhì)粒的菌株外，其他菌株均在408 nm處出現(xiàn)Soret峰值(圖5)。分析此處峰值表明，與pD菌株0.637相比，共表達(dá)菌株pAD為0.794，可知將TfuDyP與hemA基因共表達(dá)，增強(qiáng)了DyP與輔因子血紅素的結(jié)合度。此外，在pAD菌株培養(yǎng)基中外源添加 FeCl2、Glu分別將峰值提高至0.865、0.889，結(jié)合圖4的結(jié)果，表明前體物質(zhì)的加入提高了血紅素輔因子的含量，最終使得酶蛋白與血紅素輔因子結(jié)合度進(jìn)一步增加。

圖5 TfuDyP的光譜吸收?qǐng)DFig.5 UV-Vis spectrum of TfuDyP

2.5 TfuDyP的酶活性檢測(cè)

以ABTS為底物測(cè)定TfuDyP酶活性，測(cè)定結(jié)果如圖6所示。單獨(dú)過表達(dá)TfuDyP的菌株pD酶活為4.5 U/mg，而共表達(dá)菌株pAD酶活性達(dá)到9.2 U/mg，比原來提高110%。共表達(dá)菌株酶活力提高的原因可能歸因于血紅素代謝途徑hemA的表達(dá)，由于胞內(nèi)血紅素含量提高，使得TfuDyP結(jié)合輔因子量增加[9,20]。在pAD菌株培養(yǎng)基中外源添加 FeCl2、Glu分別將TfuDyP的酶活提高至11.8、13.2 U/mg。結(jié)合圖5的結(jié)果，表明前體物質(zhì)的加入使得酶蛋白與血紅素輔因子結(jié)合度增加，酶活性進(jìn)一步提高，二者成正相關(guān)性。

圖6 重組菌的酶活性Fig.6 Enzyme activity for recombinant strains

2.6 TfuDyP對(duì)不同染料脫色活性的增強(qiáng)

為了探究TfuDyP對(duì)不同染料溶液的降解活性是否增強(qiáng)，選用RB19、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)作為底物，進(jìn)行TfuDyP的脫色測(cè)定。將不同染料與酶反應(yīng)前后的溶液在280～700 nm進(jìn)行掃描，反應(yīng)前后不同染料溶液的吸收光譜圖見圖7。由圖7可知,RB19、溴酚藍(lán)、溴甲酚綠溶液分別在其最大吸收波長(zhǎng)595、591、620 nm處的吸收峰減弱，說明染料溶液在酶的作用下存在降解。分析重組菌株對(duì)不同染料脫色率方面發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)表達(dá)菌株pD對(duì)RB19、溴甲酚綠、溴酚藍(lán)脫色率分別為24.4%、53.9%、49.9%，共表達(dá)菌株pAD依次提高到37.4%、63.2%、59.1%。這表明共表達(dá)菌株在胞內(nèi)血紅素增加后，酶活性得到增強(qiáng)。此外，對(duì)pAD菌株培養(yǎng)基外源添加FeCl2、Glu脫色率逐步得到提高，這是可能因?yàn)橥庠刺砑友t素前提后，胞內(nèi)血紅素進(jìn)一步積累，酶活力增強(qiáng)。其中，外源添加FeCl2脫色率提高到42.7%、71.2%、67.5%，添加Glu效果較好，脫色率進(jìn)一步提高到53.3%、87.8%、84.2%。結(jié)果展示了這種代謝工程策略的可行性，由hemA與TfuDyP基因共表達(dá)產(chǎn)生的重組系統(tǒng)，使得TfuDyP在生物降解染料活性方面有所提高，在pAD菌株培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)的前提下脫色活性也相應(yīng)增強(qiáng)。

a-RB19溶液；b-溴酚藍(lán)溶液；c-溴甲酚綠溶液圖7 不同染料溶液酶反應(yīng)前后的吸收光譜圖Fig.7 Absorption spectrum before and after enzymatic reaction of different dye solutions

圖8 重組菌的染料脫色率Fig.8 Efficiency of dye decolorization for recombinant strains

3 結(jié)論

染料脫色過氧化物酶(DyP)是血紅素過氧化物酶家族中的新家族，以血紅素為輔基，過氧化氫為電子受體，催化多種有機(jī)物[21]。在目前研究發(fā)現(xiàn)，DyP酶類常因胞內(nèi)血紅素輔因子的不足，不能形成有效的全酶形態(tài)，導(dǎo)致其酶催化活性較低。雖然通過外源直接添加血紅素，能有效提高其催化活性，但由于成本高，不利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。在大腸桿菌中，hemA基因編碼的谷氨酰-tRNA還原酶能以谷氨酰-tRNA為底物，催化生成谷氨酰-1-半醛是細(xì)菌血紅素合成限速步驟之一。本研究利用大腸桿菌血紅素合成途徑，提高內(nèi)源血紅素含量，增加酶蛋白與輔因子的結(jié)合，最終增強(qiáng)重組TfuDyP的催化活性。對(duì)不同染料溶液的脫色率方面分析，也展示出共表達(dá)后的TfuDyP與最初酶活性相比具有更好的應(yīng)用性。以上研究為重組TfuDyP的研究及工業(yè)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。