熊去氧膽酸通過干擾白介素-10對小鼠肥胖風(fēng)險的影響

高黎黎 張昊

[摘要]目的：探索熊去氧膽酸（UDCA）通過干擾脂肪組織中白介素-10（IL-10）的水平，對高脂飼料誘導(dǎo)小鼠肥胖風(fēng)險的影響。方法：將C57BL/6J雄鼠簡單隨機化分為：Control組、DIO組、+UDCA組及+UDCA+IL-10組，于誘導(dǎo)0、6及8周后測量體重。取小鼠腸系膜白色脂肪（mesenteric white adipose tissue，mWAT），ELISA和western-blot法檢測mWAT中IL-10和IL-10Rα的蛋白濃度;RT-PCR法檢測產(chǎn)熱基因的表達水平。結(jié)果：誘導(dǎo)6周后，Control組小鼠體質(zhì)量較其它高脂誘導(dǎo)組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;8周后，高脂誘導(dǎo)小鼠中，DIO組小鼠體重最高，+DUCA+IL-10組次之，+DUCA組最低。DIO組mWAT中IL-10含量較Control組高（37.13pg/mg vs 16.29pg/mg， P<0.01），+DUCA組的IL-10含量（19.04pg/mg）較DIO組低（P<0.01），+DUCA+IL-10組的IL-10含量（33.87pg/mg）較+DUCA組高（P<0.05）。此外，各組mWAT中IL-10Rα水平的變化趨勢與IL-10相似。+DUCA組mWAT中多個線粒體產(chǎn)熱基因的表達較DIO組上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：UDCA可減少高脂誘導(dǎo)小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα水平，增加脂肪細胞線粒體產(chǎn)熱基因的表達，降低小鼠的肥胖風(fēng)險;該效果可被外源性IL-10削弱。

[關(guān)鍵詞]熊去氧膽酸;白介素-10;產(chǎn)熱基因;肥胖;風(fēng)險

[中圖分類號]R589 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）01-0068-04

Effects of Ursodeoxycholic Acid on the Risk of Obesity in Mice Via Inhibiting Interleukin-10

GAO Li-li1，ZHANG Hao2

（1.Center for Medical Research and Innovation;2.Department of General Surgery，Shanghai Pudong Hospital/Fudan University Pudong Medical Center，Shanghai 201399，China）

Abstract： Objective ?To explore the effect of ursodeoxycholic acid（UDCA） on the risk of obesity via inhibiting interleukin-10（IL-10） level in high-fat diet-induced mice. Methods ?Male C57BL/6 mice were divided into four groups using simple random method， including Control group， DIO group， +UDCA group and +UDCA+IL-10 group， body weight were monitored at baseline， 6 weeks and 8 weeks after feeding. Meanwhile， the mesenteric white adipose tissue （mWAT） was collected， and the IL-10 and IL-10Rα protein level were detected by ELISA and western blot assays respectively， then the expression of thermogenic genes were analyzed by real-time PCR. Results ?Compared with other groups， the body weight value of the Control group was the lowest following 6 weeks induction （P<0.05）. After 8 weeks， in high-fat diet-induced mice， the DIO group had the highest body weight， followed by the the +DUCA+IL-10 group and the lowest in the +DUCA group （P<0.05）. In addition， the IL-10 level of mWAT in DIO group was higher than that in the Control group（37.13pg/mg vs 16.29pg/mg， P<0.01）， it was lower in the +UDCA group（19.04pg/mg） than that in the DIO group （P<0.01）， and it was higher in the +UDCA+IL-10 group（33.87pg/mg） than that in the +UDCA group （P<0.05）. As well， the trend of IL-10Rα levels among the groups was similar with IL-10. Whereas most of the mitochondrial thermogenic genes abundance were down-regulated in the DIO group， and up-regulated in the +DUCA group （P<0.05）. Conclusion ?We conclude that UDCA could reduce IL-10 and IL-10Rα levels in WAT， increase mitochondrial thermogenic genes expression in adipocytes， and finally alleviate the risk of obesity in high-fat-diet-induced mice. Importantly， the treatment of exogenous IL-10 could eliminate the role of UDCA in resisting obesity.

Key words： ursodeoxycholic acid; interleukin-10（IL-10）; thermogenic genes; obesity; risk

近年來，一些研究證明了免疫系統(tǒng)對脂肪組織的增殖和活化有明顯影響，強調(diào)了抗炎（Ⅱ型）細胞因子在調(diào)節(jié)脂肪產(chǎn)熱中的重要性。嗜酸性細胞在刺激下產(chǎn)生白細胞介素-4（IL-4）/IL-13，激活產(chǎn)熱過程[1-2]。IL-33激活2型先天淋巴細胞（IL-C2），促進米色脂肪生源論[3]。最近，IL-33被證明通過調(diào)節(jié)解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCPl）的剪接促進脂肪細胞進行非耦合呼吸[4]。白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）是一種多細胞源、多功能的細胞因子[5]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)IL-10可通過調(diào)節(jié)脂肪細胞的染色質(zhì)重構(gòu)，限制白色脂肪組織的產(chǎn)熱和能量消耗[6]。因此，尋找有效藥物阻斷IL-10限制脂肪能耗或?qū)⒊蔀橹委煾咧嬍痴T發(fā)的代謝紊亂的研究目標。

熊去氧膽酸（UDCA）是親水性膽汁酸（BA）并已作為膽汁淤積和慢性肝炎的保肝藥物;它也是經(jīng)美國食品藥品管理局批準用于治療原發(fā)性膽汁膽管炎（PBC）的一種藥物[7-8]。最近研究顯示，UDCA能調(diào)節(jié)多個分子靶點，發(fā)揮抗炎、降脂和改善糖代謝的作用，具有治療肥胖及肥胖所致的代謝性疾病的潛能[9]。但其具體的作用機制不是十分清楚。隨著現(xiàn)代社會肥胖和肥胖相關(guān)代謝性疾病的高發(fā)，闡明UDCA作為一種安全、有效的肥胖治療手段的機制備受關(guān)注。有研究顯示，UDCA能抑制高脂誘導(dǎo)小鼠肝臟IL-10的表達[10]。那它對脂肪內(nèi)IL-10的調(diào)控如何，能否通過對IL-10水平的干擾影響脂肪組織的能量代謝水平，緩解肥胖。本實驗以高脂誘導(dǎo)小鼠為模型，探索UDCA通過干擾脂肪組織中IL-10的水平，對高脂飼料誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肥胖風(fēng)險的影響，為研究UDCA減輕機體肥胖的作用機制提供理論依據(jù)。

1 ?資料和方法

1.1 動物模型：SPF級雄性C57BL/6J小鼠，8周齡， 體質(zhì)量（20±2）g，購買自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK（滬）2012-0002]。簡單隨機化分為4組，每組8只：①Control組（普通喂養(yǎng)）;②DIO組（高脂誘導(dǎo)，美國，Research Diets，D12492）;③+UDCA組（高脂+UDCA誘導(dǎo)）;④+UDCA+IL-10組（高脂+UDCA+IL-10誘導(dǎo)）。從第7周起，對+UDCA組、+UDCA+IL-10組行UDCA灌胃2周（50mg/kg，1次/d，UDCA原液溶解在33%乙醇，33%二甲亞砜，33%吐溫-80中，使用時按1：50稀釋于0.5M NaCl溶液;UDCA，Sigma-Aldrich，U5127）。第8周起，對+UDCA+IL-10組行IL-10腹腔注射干預(yù)1周（10μg/kg，隔天1次，共計4次;IL-10，PEPRO-TECH，210-10）。干預(yù)結(jié)束后處死小鼠，取腸系膜脂肪組織（mesenteric white adipose tissue， mWAT）凍存。

1.2 方法

1.2.1 體質(zhì)量檢測：分別檢測各組小鼠基線和誘導(dǎo)6周及8周后的體質(zhì)量，檢測前禁食6h，正常給水。

1.2.2 Real-time PCR：按說明書將儲于液氮的mWAT取50g研磨成勻漿后，提取總RNA并測其濃度及A260：A280值，取比值1.8～2.0者，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用兩步法PCR擴增標準程序：預(yù)變性，95℃ 10min，1個循環(huán)進行cDNA變性;PCR反應(yīng)：95℃ 15s，59℃ 1min。40個循環(huán)放大;熔化曲線分析（60℃～95℃），以驗證單個產(chǎn)品的存在。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。內(nèi)參為GAPDH基因，使用 delta-delta Ct方法計算mRNA水平：2-ΔΔCT，ΔΔCT=（Ct目標基因-CtGAPDH）實驗組-（Ct目標基因-CtGAPDH）對照組，見表1。

1.2.3 Western-blot法：組織勻漿后，14 000r/min離心5min提取蛋白，取上清定量后加入上樣緩沖液于8%的SDS-PAGE，完畢后轉(zhuǎn)膜。牛奶封閉后，分別加入1：1 000的IL-10Rα抗體（ab225820，abcam）及1：1 000的β-actin抗體（4967L，CST）4℃孵育過夜后，TBST 漂洗2遍，加入用辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1h，洗膜后曝光。

1.2.4 ELISA法：組織樣本mWAT（0.3g）置于800μl預(yù)冷提取緩沖液（100mM Trizma Base pH7.5， 10mM EDTA，100mM NaF，10mM Na4P2O7，10mM Na3VO4，2mM PMSF，0.1mg/ml 抑肽酶）。勻漿后，添加80μl 10% Triton X-100至樣品，冰上放置30min，4℃離心40min（20817g）。吸取上清，以牛血清白蛋白為參照，采用Bradford法測定蛋白濃度。定量測定IL-10蛋白濃度，ELISA（DuoSet ELISA、R&D Systems，Minneapolis，MN，USA），重復(fù)測量，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用x?±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。采用GraphPad Prism 7軟件以x?±s形式作圖。

2 ?結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較：各組小鼠的體質(zhì)量基線水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.79，P>0.05）。造模8周后，與Control組比較，DIO組小鼠體質(zhì)量增長較為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.86，P<0.001）;與DIO組相比，+UDCA組體質(zhì)量降低（t=4.55，P<0.001）;與UDCA組相比，+UDCA+IL-10組體質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.91，P<0.05）。見表2。

2.2 各組小鼠mWAT中IL-10濃度比較：ELISA測定mWAT的IL-10蛋白濃度，結(jié)果顯示DIO組IL-10含量為37.13pg/mg，較Control組16.29pg/mg增高（t=4.04，P<0.01），說明高脂誘導(dǎo)可以引起小鼠mWAT中IL-10含量的增高;+DUCA組IL-10含量為19.04pg/mg，較DIO組下降（t=3.51，P<0.01），說明+UDCA干預(yù)可以引起小鼠mWAT中IL-10的含量減低;+DUCA+IL-10組IL-10含量為33.87pg/mg，較+DUCA組增加（t=2.87，P<0.05），腹腔IL-10注射可提高mWAT中IL-10的濃度。見圖1。

2.3 各組小鼠mWAT中IL-10Rα表達水平：Western-blot檢測結(jié)果顯示，DIO組mWAT中IL-10Rα的蛋白水平較Control組和+DUCA組高，+DUCA+IL-10組IL-10Rα的蛋白水平較Control組和+DUCA組高，與IL-10含量的變化趨勢相似，見圖2。

2.4 各組小鼠mWAT中線粒體產(chǎn)熱基因的表達： 以各組小鼠mWAT中UCP1、Cidea、Cox8b、pGC-1α及Pdgfrα基因表達水平作為脂肪產(chǎn)熱指標，RT-PCR結(jié)果顯示，與Control組相比，DIO組中UCP1、Cidea及pGC-1α的表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與DIO組相比，+UDCA組中UCP1、Cidea、Cox8b及pGC-1α的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與+UDCA組相比，+UDCA+IL-10組中UCP1、Cidea、Cox8b及pGC-1α的表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。UDCA干預(yù)能提高高脂誘導(dǎo)小鼠mWAT中線粒體UCP1的水平，促進產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達，IL-10干預(yù)會減弱這種效應(yīng)，見圖3。

3 ?討論

IL-10是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，主要通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）發(fā)揮抗炎與免疫抑制作用[11]。關(guān)于IL-10對脂肪和能量穩(wěn)態(tài)作用的觀點卻不同。Mauer等認為IL-10不具有抵抗肥胖的功能[12-13]。但P Rajbhandari等指出IL-10能參與抑制脂肪細胞產(chǎn)熱基因的表達，促進飲食誘導(dǎo)肥胖的發(fā)生;IL-10Rα是富集于白色和米色脂肪細胞表面的IL-10受體的亞單位，并隨著分化水平和機體肥胖程度逐漸上調(diào)[6]。本研究顯示高脂誘導(dǎo)能增加小鼠白色脂肪mWAT中IL-10濃度和IL-10Rα的表達，與后者研究結(jié)果基本一致。

在哺乳動物體內(nèi)，存在3種類型脂肪組織：白色脂肪組織（White adipose tissue，WAT）、棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT）和米色脂肪組織。其中，一般情況下WAT以甘油三酯的形式儲存能量，線粒體含量少。BAT含有豐富的線粒體，線粒體中存在的UCP1可將部分用于制造ATP的能量轉(zhuǎn)化為熱量。然而，人們在WAT中發(fā)現(xiàn)了米色脂肪組織與BAT相似，米色脂肪細胞的生成通常伴隨著機體的產(chǎn)熱作用增強，脂肪代謝增加及體質(zhì)量減輕[14]。米色脂肪組織可由前體細胞和白色脂肪細胞轉(zhuǎn)分化而來，表達高水平的UCP1[15-16]。因此，將豐富的白色脂肪轉(zhuǎn)化為米色脂肪，促進脂肪細胞線粒體UCP1產(chǎn)熱，是對抗肥胖的有效方法。

研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食導(dǎo)致的肥胖大鼠模型體內(nèi)膽汁酸的水平明顯降低[17]，而給予小鼠UDCA后能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖[18]。一方面，是由于膽汁酸會通過激活TGR5依賴型2型碘甲狀腺原氨酸脫碘酶（D2）來增加小鼠BAT和人類骨骼肌的能量消耗，D2是負責(zé)將甲狀腺素（T4）轉(zhuǎn)化為三碘甲狀腺原氨酸的主要酶（T3）[19-20]。生物活性T3誘導(dǎo)線粒體生物發(fā)生和UCP1的表達，促進游離脂肪酸氧化和增加能量消耗[21-22]。另一方面，本文通過動物實驗探索發(fā)現(xiàn)，UDCA對限制熱量消耗的分子有調(diào)節(jié)作用。UDCA干預(yù)可降低IL-10及IL-10Rα蛋白水平，提高線粒體部分產(chǎn)熱基因的表達，緩解IL-10對肥胖小鼠脂肪能量消耗的抑制;但外源性IL-10的輸入又會增加小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα，逆轉(zhuǎn)UDCA抵抗肥胖風(fēng)險的作用。

綜上所述，UDCA干預(yù)可以降低高脂誘導(dǎo)小鼠白色脂肪中IL-10和IL-10Rα水平，增加脂肪細胞線粒體產(chǎn)熱基因的表達，預(yù)防小鼠的肥胖風(fēng)險，該效果可被外源性IL-10削弱。

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[收稿日期]2019-05-20

本文引用格式：高黎黎，張昊.熊去氧膽酸通過干擾白介素-10對小鼠肥胖風(fēng)險的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2020，29（1）：68-71.