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    雷公藤甲素普通脂質(zhì)體與包合物脂質(zhì)體體外釋藥特點對比分析*

    2020-03-16 08:41:00羅國平閆夢茹孟會寧張孟麗王小寧
    化工科技 2020年1期
    關(guān)鍵詞:藥率釋藥甲素

    羅國平,閆夢茹,孟會寧,張孟麗,陳 程,王小寧

    (1.西安醫(yī)學院 藥學院,陜西 西安 710021; 2.山東步長醫(yī)藥銷售有限公司,山東 菏澤 274418)

    脂質(zhì)體是一種具有類生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子層微囊,可作為水溶性藥物和疏水性藥物的載體,前者包載于脂質(zhì)體的內(nèi)水相,后者包載于脂質(zhì)體雙分子層內(nèi)。目前,脂質(zhì)體主要用于包載水溶性藥物,而疏水性藥物易受到藥脂比等因素的限制,且某些疏水性藥物還會干擾脂質(zhì)雙分子層的結(jié)構(gòu),從而影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,使其在貯存過程發(fā)生藥物泄漏。近年來有研究發(fā)現(xiàn),利用環(huán)糊精(CD)與脂質(zhì)體各自具備的優(yōu)點,制備環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體,可以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性,減少藥物泄漏,提高載藥量,改變藥物的體內(nèi)行為,同時使其在人體體內(nèi)釋藥過程中具有緩釋性,延長藥物的作用時間[1]。在環(huán)糊精材料中,β-環(huán)糊精(β-CD)應用范圍廣,但水溶性較差;羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)為環(huán)糊精衍生物,是在β-CD母體結(jié)構(gòu)基礎上引入羥丙基,打破了β-環(huán)糊精的分子內(nèi)環(huán)狀氫鍵,在保持環(huán)糊精空腔的同時克服了β-環(huán)糊精水溶性差的缺點。雷公藤甲素是從雷公藤的根部中提取而來,是一個具有多種生物活性的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物,為治療類風濕病制劑的主要有效成分,其水溶性差,生物利用度較低[2-3]。作者分別將雷公藤甲素包載于普通脂質(zhì)體、β-CD包合物脂質(zhì)體和HP-β-CD包合物脂質(zhì)體中[4-5],采用透析法進行體外釋藥實驗,對比分析雷公藤甲素3種不同脂質(zhì)體的體外釋藥特點,為制備穩(wěn)定性好、載藥量大、生物利用度高和緩釋長效的雷公藤甲素皮膚外用型制劑打基礎[6]。

    1 實驗部分

    1.1 試劑與儀器

    雷公藤甲素原料藥:質(zhì)量分數(shù)96.8%,西安匯林生物科技有限公司;雷公藤甲素對照品:批號B20709,上海源葉生物科技有限公司;卵磷脂、膽固醇:藥用規(guī)格,山東巨榮生物工程有限公司;β-CD,HP-β-CD:藥用輔料,北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;乙醇:體積分數(shù)95%,1,2-丙二醇:分析純,天津永晟精細化工有限公司;甲醇:色譜純,無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉:分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;透析袋:6 mm,截留相對分子質(zhì)量14 000,上海源葉生物科技有限公司。

    集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S,鞏義市予華儀器有限責任公司;紫外分光光度計:Agilent Tech.Cary60UV-Vis,高效液相色譜儀:Agilent Tech.1260,美國安捷倫科技有限公司;臺式高速離心機:TG-1650-WS,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;超聲波清洗機:SB-5200DT,寧波新芝生物科技股份有限公司;電子天平:BT125D,賽多斯科學儀器(北京)有限公司;馬爾文激光粒度儀:ZEN-3600Malvern,英國馬爾文儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器:ZHWY-100B,上海智城分析儀器制造有限公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 雷公藤甲素3種脂質(zhì)體的制備

    (1)雷公藤甲素普通脂質(zhì)體的制備[7]

    精密稱取雷公藤甲素、卵磷脂和膽固醇適量,置100 mL燒杯中,加入10 mL無水乙醇,超聲(200 W,80 kHz)溶解后備用;攪拌(100 r/min)條件下將12 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.4,后同)緩慢注入上述溶液中,繼續(xù)攪拌20 min,取出,超聲(200 W,80 kHz)處理2 min,離心(離心力7 172×g)15 min,取沉淀另器保存,即得雷公藤甲素普通脂質(zhì)體。

    (2)雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體的制備[8-9]

    參考文獻[2],m(β-CD)∶m(雷公藤甲素)=10∶1制得的包合物有較高的包封率。精密稱取β-CD粉末,加入45 ℃蒸餾水溶解制成飽和溶液;另精密稱取雷公藤甲素粉末,加適量無水乙醇溶解后攪拌(800 r/min)條件下加入到上述制備好的β-CD飽和溶液中,保溫45 ℃并繼續(xù)攪拌2 h,然后冷藏24 h,取出,離心(離心力7 172×g)10 min,沉淀干燥(45 ℃)后另器保存,即得雷公藤甲素β-CD包合物。

    精密稱取卵磷脂和膽固醇適量,置100 mL燒杯中,加入10 mL無水乙醇,超聲(200 W,80 kHz)溶解后備用;取上述雷公藤甲素β-CD包合物適量,加12 mL PBS溶液溶解,攪拌(100 r/min)條件下緩慢注入上述卵磷脂、膽固醇無水乙醇溶液中,繼續(xù)攪拌20 min,取出,超聲(200 W,80 kHz)處理2 min,離心(離心力7 172×g)15 min,取沉淀另器保存,即得雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體。

    (3)雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的制備

    精密稱取HP-β-CD粉末,加入45 ℃蒸餾水溶解;另精密稱取雷公藤甲素粉末,加適量無水乙醇溶解后攪拌(800 r/min)條件下加入到上述制備好的HP-β-CD溶液中,保溫45 ℃并繼續(xù)攪拌2 h,取出,冷凍干燥后另器保存,即得雷公藤甲素HP-β-CD包合物。

    精密稱取卵磷脂和膽固醇適量,置100 mL燒杯中,加入10 mL無水乙醇,超聲(200 W,80 kHz)溶解后備用;取上述雷公藤甲素HP-β-CD包合物適量,加12 mL PBS溶液溶解,攪拌(100 r/min)條件下緩慢注入上述豆卵磷脂、膽固醇無水乙醇溶液中,繼續(xù)攪拌20 min,取出,超聲(200 W,80 kHz)處理2 min,離心(離心力7 172×g)15 min,取沉淀另器保存,即得雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體。

    1.2.2ρ(雷公藤甲素)測定

    (1)雷公藤甲素最大吸收波長的檢測

    取雷公藤甲素對照品溶液,用紫外分光光度計在波長200~400 nm掃描吸收曲線。

    (2)ρ(雷公藤甲素)的測定方法[10]

    采用HPLC法,色譜柱:Agilent 5 TC-C18,150 mm×4.6 mm,流動相:V(水)∶V(甲醇)=50∶50,檢測波長:218 nm,流速:1.0 mL/min,柱溫:25 ℃,進樣量:20 μL分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,分別進樣20 μL,記錄色譜圖。另取雷公藤甲素對照品,加甲醇分別配成質(zhì)量濃度為6.64、19.92、33.20、53.12、79.68 μg/mL的對照品溶液,分別進樣20 μL,記錄峰面積(A),以雷公藤甲素的質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標,進行線性回歸。

    1.2.3 體外釋藥實驗

    采用透析袋擴散法進行體外釋藥實驗[11-14],釋放介質(zhì)通常為生理鹽水和PBS溶液,由于雷公藤甲素的溶解度小,故選擇PBS溶液、φ(乙醇)=20%生理鹽水和φ(乙醇)=40%生理鹽水3種釋放介質(zhì)。具體操作為分別取1.2.1制得的雷公藤甲素3種脂質(zhì)體沉淀(均相當于雷公藤甲素1.25 mg),各加入1 mL甲醇(破囊劑)和1 mL PBS溶液,置透析袋中,將透析袋放入裝有20 mL釋放介質(zhì)的離心管中(注意透析袋內(nèi)外液面一致),再將離心管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中,控制轉(zhuǎn)速為100 r/min,恒溫釋放24 h,分別于第1、2、4、6、8、12、24 h 7個時間點吸取1 mL釋放介質(zhì)(同時補充等體積新鮮釋放介質(zhì)),過濾(0.45 μm微孔濾膜),取續(xù)濾液20 μL進樣,用HPLC法測定ρ(雷公藤甲素),并按照式(1)計算各時間點雷公藤甲素的累積釋藥率。以取樣時間為橫坐標,累積釋藥率為縱坐標繪制釋藥曲線。

    (1)

    式中:ρi和ρn分別為第i次和第n次取樣時,釋放介質(zhì)中ρ(雷公藤甲素),mg/mL;V為釋放介質(zhì)的體積,mL;Vi為第i次的取樣體積,mL;m為脂質(zhì)體樣品中雷公藤甲素的總質(zhì)量,mg。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 ρ(雷公藤甲素)測定

    2.1.1 雷公藤甲素最大吸收波長的檢測

    雷公藤甲素對照品溶液波長200~400 nm吸收曲線見圖1。

    λ/nm圖1 雷公藤甲素對照品吸收曲線

    2.1.2ρ(雷公藤甲素)測定方法

    雷公藤甲素對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液HPLC圖見圖2。

    t/min圖2 對照品、供試品與陰性對照溶液的色譜圖

    由圖2可知,供試品溶液中雷公藤甲素的色譜峰與雜質(zhì)峰之間能得到很好的分離,且輔料對主藥的測定無干擾,方法專屬性良好。以雷公藤甲素質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標,峰面積(A)為縱坐標,進行線性回歸得回歸方程:y=253 82x-9.201 6,r=0.999 9,說明ρ(雷公藤甲素)=6.64~79.68 mg/mL線性關(guān)系良好。

    2.2 體外釋藥實驗

    2.2.1 不同釋放介質(zhì)對釋藥的影響

    雷公藤甲素同一種脂質(zhì)體分別在3種不同的釋放介質(zhì)中的釋藥曲線,見圖3。

    t/ha 雷公藤甲素普通脂質(zhì)體

    t/hb 雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體

    t/hc 雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體圖3 雷公藤甲素3種脂質(zhì)體分別在3種釋放介質(zhì)中的釋藥曲線

    由圖3可知,t=0~1 h,雷公藤甲素普通脂質(zhì)體在3種釋放介質(zhì)中的釋藥速度相當;t=1~8 h,釋藥速率有差異,排序為PBS溶液>φ(乙醇)=20%生理鹽水>φ(乙醇)=40%生理鹽水;t=8~24 h,釋藥速率較慢,基本趨于平穩(wěn);24 h內(nèi)的累積釋藥率均約為70%。雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體在3種釋放介質(zhì)中的釋藥速率和各時間點的累積釋藥率排序均為φ(乙醇)=20%生理鹽水>φ(乙醇)=40%生理鹽水>PBS溶液,24 h內(nèi)的累積釋藥率分別約為80%、70%和60%。雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體在3種釋放介質(zhì)中的釋藥速率和各時間點的累積釋藥率都相當,無顯著差異,且24 h內(nèi)的累積釋藥率均約為90%。由此可見,同一種脂質(zhì)體在不同釋放介質(zhì)中的釋放曲線不盡相同,有時差異還很大。

    2.2.2 不同脂質(zhì)體對釋藥的影響

    雷公藤甲素3種不同的脂質(zhì)體分別在同一種釋放介質(zhì)中的釋藥曲線,見圖4。

    t/ha PBS溶液

    t/hb φ(乙醇)=20%生理鹽水

    t/hc φ(乙醇)=40%生理鹽水圖4 雷公藤甲素3種脂質(zhì)體分別在3種釋放介質(zhì)中的釋藥曲線

    由圖4可知,3種脂質(zhì)體分別在φ(乙醇)=20%生理鹽水和φ(乙醇)=40%生理鹽水中的釋藥曲線差異很小,與在PBS溶液中的釋藥曲線差異較大,主要原因是φ(乙醇)=20%生理鹽水和φ(乙醇)=40%生理鹽水的組成相似。同時也可以看到,在同一種釋放介質(zhì)中,不同種類脂質(zhì)體的釋藥曲線也不同,分析其主要原因是不同種類脂質(zhì)體的構(gòu)成有差異,雷公藤甲素普通脂質(zhì)體中藥物包載在脂質(zhì)雙分子層內(nèi),而雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體和HP-β-CD包合物脂質(zhì)體中藥物包載在內(nèi)水相中,導致普通脂質(zhì)體與包合物脂質(zhì)體的釋藥過程會有差異;另外,同樣是包合物脂質(zhì)體,不同包合材料由于溶解性的差異和空間位阻效應也會造成釋藥過程的變化。

    通過上述分析可知,不同釋放介質(zhì)會對3種雷公藤甲素脂質(zhì)體的體外釋藥曲線造成不同程度的影響,影響最大的是β-CD包合物脂質(zhì)體、其次是普通脂質(zhì)體,影響最小的是HP-β-CD包合物脂質(zhì)體??紤]到體外實驗的條件應盡可能與人體體液條件接近,因此最終確定PBS溶液作為雷公藤甲素3種脂質(zhì)體體外釋藥實驗的釋放介質(zhì)。

    2.2.3 3種載藥脂質(zhì)體在PBS溶液中的釋藥特點

    雷公藤甲素3種脂質(zhì)體在PBS溶液中的釋藥特點對比分析,結(jié)果見圖5。

    t/h圖5 3種脂質(zhì)體在PBS溶液中的累積釋藥率趨勢圖

    由圖5可知,t=0~4 h,雷公藤甲素普通脂質(zhì)體的釋藥速率最快,其次為雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體,雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體釋藥速率最慢;從4 h開始,雷公藤甲素HP-β-CD脂質(zhì)體釋藥速率明顯加快,在約5 h,累積釋藥率超過雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體,在約8 h,累積釋藥率超過雷公藤甲素普通脂質(zhì)體;t=8~24 h,雷公藤甲素普通脂質(zhì)體的累積釋藥率基本達到平衡,而雷公藤甲素β-CD包合物脂質(zhì)體和HP-β-CD包合物脂質(zhì)體還持續(xù)緩慢釋放;24 h內(nèi)的累積釋藥率排序由高到低為雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體>普通脂質(zhì)體>β-CD包合物脂質(zhì)體,累積釋藥率依次為90.0%、73.0%和60.0%。

    3 結(jié) 論

    作者將雷公藤甲素分別用β-CD和HP-β-CD包合后再包封于脂質(zhì)體的內(nèi)水相形成包合物脂質(zhì)體,與制備的雷公藤甲素普通脂質(zhì)體通過體外釋藥實驗進行對比分析,發(fā)現(xiàn)(1)同一種脂質(zhì)體在不同釋放介質(zhì)中的釋藥曲線會有差異,不同類型脂質(zhì)體在同一種釋放介質(zhì)中的釋藥曲線也不一樣;(2)與普通脂質(zhì)體相比,β-CD包合物脂質(zhì)體具有明顯的持續(xù)緩釋作用,而HP-β-CD包合物脂質(zhì)體釋藥初期具有緩釋作用,中期釋藥加速,后期又趨緩;β-CD包合物脂質(zhì)體和HP-β-CD包合物脂質(zhì)體釋藥行為差異的主要原因是不同包合材料的溶解度和空間位阻效應不同;(3)雷公藤甲素HP-β-CD包合物脂質(zhì)體的釋藥最為充分,24 h內(nèi)的累積釋藥率達90.0%,其原因是HP-β-CD具有良好的水溶性[15]。通過對比分析雷公藤甲素3種不同脂質(zhì)體的體外釋藥特點,可為制備穩(wěn)定性好、載藥量大、生物利用度高和緩釋長效作用的雷公藤甲素皮膚外用型制劑打基礎。

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