高效液相色譜法測(cè)定3 種含香附制劑中α-香附酮含量*

吳 麗，周書(shū)來(lái)

（1. 四川省樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂(lè)山 614000； 2. 樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000）

香附味辛、微苦、微甘，性平[1]，主要成分為揮發(fā)油、黃酮、生物堿和糖等[2-4]，具有疏肝理氣、調(diào)經(jīng)止痛、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗抑郁、抗糖尿病、抑制乙酰膽堿酯酶活性等功效[5]。香附可與多種中藥材配伍治療相關(guān)疾病[6-7]，如檳榔四消丸消食導(dǎo)滯，行氣泄水；痛經(jīng)丸溫經(jīng)活血，調(diào)經(jīng)止痛；千金止帶丸健脾補(bǔ)腎，調(diào)經(jīng)止帶。2015 年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的1 499 種成方制劑[8]和單味制劑中，含香附制劑有107 種，但大多數(shù)含香附制劑中香附的質(zhì)量并未得到有效控制[9]。為全面評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量，建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求多組分、多靶點(diǎn)質(zhì)量控制[10]。參閱現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[11-13]，本研究中以檳榔四消丸、痛經(jīng)丸和千金止帶丸為樣品，以α-香附酮為目標(biāo)成分[14-15]，建立測(cè)定α-香附酮含量的高效液相色譜（HPLC）法，為有效提高含香附制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（配備二極管陣列檢測(cè)器和OpenLAB CDS 工作站，美國(guó)安捷倫公司）；XSE205 型DualRange 電子分析天平（精密度為0.000 01 g，瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 型超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）；ULPZY-250DROMB 型優(yōu)普系列純水設(shè)備（成都超純科技有限公司）；ULUP-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

α-香附酮對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110748-201513，純度為99.7%）；甲醇（河北百靈威超精細(xì)材料有限公司，色譜純）；磷酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司，分析純）；試驗(yàn)用水為純化水和超純水；樣品信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WelchUltimate LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（75 ∶25，V/ V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：249 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取α-香附酮對(duì)照品23.29 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品貯備溶液；精密量取對(duì)照品貯備溶液2 mL，置25 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取3 種含香附制劑樣品適量，粉碎，各稱取6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 甲醇，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）1 h，放冷后，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，即得3 種含香附制劑的供試品溶液。按3 種含香附制劑處方和工藝制備不含香附的陰性樣品，同供試品溶液制備方法制成3 種不含香附的陰性對(duì)照品溶液。

表1 樣品信息

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取α-香附酮對(duì)照品溶液、3 種含香附制劑供試品溶液、3 種不含香附的陰性對(duì)照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果供試品溶液色譜中α-香附酮峰與相鄰峰的分離度符合要求，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明本試驗(yàn)專屬性良好。

線性關(guān)系考察：精密量取對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為線性第一點(diǎn)溶液；分別精密量取對(duì)照品貯備溶液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mL，分別置25 mL 容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得線性系列質(zhì)量濃度溶液；精密量取線性第一點(diǎn)溶液和線性系列質(zhì)量濃度溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=33.877C-5.136，r=0.999 9（n=5）。結(jié) 果 表明，α-香附酮質(zhì)量濃度在1.86 ～74.30 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

定量限測(cè)定：精密量取線性第一點(diǎn)溶液，加甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以信噪比（S/ N）為10 ∶1 計(jì)算定量限，α-香附酮定量限為0.23 μg/mL。

精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣連續(xù)，測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果α-香附酮峰面積的RSD為0.62% （n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取3 種含香附制劑的樣品各1 批[檳榔四消丸（批號(hào)為20180402），痛經(jīng)丸（批號(hào)為121809），千金止帶丸（批號(hào)為20180501）]，依法制備供試品溶液，平行6 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。表明方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取3 種供試品溶液，室溫放置，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣10 μL，按擬訂色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取3 種含香附制劑的樣品各1 批[檳榔四消丸（批號(hào)為20180402，含量為0.051 9 mg/g），痛經(jīng)丸（批號(hào)為121809，含量為0.049 4 mg/g），千金止帶丸（批號(hào)為20180501，含量為0.113 8 mg/g）]，取樣量分別為表1 中對(duì)應(yīng)量的一半，每個(gè)制劑平行取6 份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備液1 mL，依法制備3 種含香附制劑供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算α-香附酮的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 含量測(cè)定

取3 種含香附制劑樣品，依法制備供試品溶液，每批平行制備3 份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=9）

3 討論

本試驗(yàn)中，取α-香附酮適量，在240 ～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果α-香附酮在249 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)值大，可作為測(cè)定波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)中考察了超聲前的浸泡條件對(duì)α-香附酮提取的影響，結(jié)果無(wú)差異；考察超聲時(shí)間（40，50，60

，80 min）對(duì)α-香附酮提取的影響，結(jié)果超聲60 min 基本能提取完全，最終確定提取方式為直接超聲60 min。

本試驗(yàn)中涉及的5 個(gè)不同廠家5 個(gè)批次檳榔四消丸中，α-香附酮的含量為0.051 9 ～0.496 0 mg/g，質(zhì)量差異大；2 個(gè)廠家3 個(gè)批次千金止帶丸中α-香附酮的含量為0.068 4 ～0.223 0 mg/g，質(zhì)量差異也大。中藥材的次生代謝產(chǎn)物主要由植物的種類和生長(zhǎng)環(huán)境決定，也受到植物物候期及其代謝節(jié)律的調(diào)控，可能是導(dǎo)致同一廠家不同批次樣品中α-香附酮含量不一致的原因；中成藥的質(zhì)量還與生產(chǎn)工藝有關(guān)，導(dǎo)致相同產(chǎn)品、不同生產(chǎn)廠家之間質(zhì)量存在差異。

綜上所述，受多種因素影響，含香附制劑中α-香附酮含量波動(dòng)范圍較大，質(zhì)量控制十分有必要，對(duì)于制訂α-香附酮的含量控制限度，樣本量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，可考慮收集更多的樣本，制訂相應(yīng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。