基于Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路探討大黃酸對糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化的作用及機(jī)制研究

段曉星 常永麗 張國光 潘雪

010050 呼和浩特，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科

糖尿病腎病是糖尿病常見的并發(fā)癥，其病情發(fā)展過程中可導(dǎo)致主動(dòng)脈鈣化，主動(dòng)脈鈣化不僅會(huì)影響血管內(nèi)皮功能，還會(huì)增加心血管并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前臨床上針對糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化患者主要采用鈣模擬劑、磷結(jié)合劑、活性維生素D等進(jìn)行治療，但是療效不佳[2]。有研究指出[3]，在糖尿病腎病大鼠中給予大黃酸干預(yù)不僅腎功能指標(biāo)能夠顯著改善，且血鈣、血磷水平和鈣磷乘積均顯著改善，推測該藥物能夠保護(hù)糖尿病腎病患者的腎功能，可用于治療糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化，但其具體治療作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。另有研究發(fā)現(xiàn)，人跨膜受體蛋白Notch-1通路(Notch1-recombining binding protein suppressor of hairless，Notch1-RBP-Jk)/相互作用蛋白Msx2(Msx2-interacting nuclear target protein，Msx2)信號通路是經(jīng)典的主動(dòng)脈鈣化調(diào)控路徑[4]。本研究特進(jìn)行大鼠實(shí)驗(yàn)探討大黃酸對Notch1-RBP-Jk/Msx2信號通路是否具有調(diào)控作用以及其對糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化的影響，以期為此類疾病的臨床治療和藥物研發(fā)提供新的思路。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

40只成年SD大鼠，均購自北京醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物合格證號：SCXK(京)2018-012)，6～8周齡，雄性，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，平均體質(zhì)量(196.8±5.1)g。

大黃酸購自廣州佳科生物科技有限公司(純度95%)；維生素D3注射液購自浙江仙琚制藥股份有限公司；尼古丁購自Merck公司(純度>95%)；24 h尿蛋白比濁法檢測試劑盒、血肌酐酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、血尿素氮電極法檢測試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒、組織鈣含量定量檢測熒光試劑盒、總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒、蛋白提取試劑盒均購自上海信帆生物科技有限公司；Von Kossa染料購自美國Sigma公司；一抗、二抗(以辣根酶標(biāo)記)均購自武漢博士德公司；引物序列由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。

AU5800型全自動(dòng)生化分析儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司；DSX500型光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；DYCP-31A型快速電泳儀購自北京六一儀器廠；SCZX/ABI2720型聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

二、方法

1.分組、建模及干預(yù)方法 在40只大鼠中隨機(jī)選取32只建立糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化模型。剩余8只大鼠記為正常對照組，自由飲食和進(jìn)水。建模方法參照文獻(xiàn)[5]給予高脂飼料喂養(yǎng)，持續(xù)4周，給予鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)溶液(1%)腹腔注射液，劑量為35 mg/kg；2周后24 h尿蛋白>30 g，尿量>原尿量的50%，則視為造模成功；然后自次日早上9時(shí)，給予維生素D3肌肉注射，劑量為300 000 U/kg，并給予25 mg/kg、5 mL/kg尼古丁灌胃，當(dāng)天晚6時(shí)再次灌胃。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，后3組分別給予50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg劑量的大黃酸灌胃，其中低劑量為臨床等效劑量、中劑量為臨床等效劑量的2倍，高劑量為臨床等效劑量的4倍。模型對照組和正常對照組均給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)4周。

2.觀察指標(biāo)

(1)腎功能指標(biāo)：分別于干預(yù)前后檢測各組大鼠的腎功能指標(biāo)，包括24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮，利用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、電極法檢測試劑盒和全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測。

(2)腹主動(dòng)脈鈣化特征：處死大鼠，迅速剝離腹主動(dòng)脈，對主動(dòng)脈管腔進(jìn)行徹底沖洗。常規(guī)固定，脫水，透明，包埋，切片，染色觀察。

(3)腹主動(dòng)脈組織鈣含量：制成腹主動(dòng)脈勻漿，離心分離，并利用熒光定量檢測試劑盒和熒光分光光度計(jì)檢測腹主動(dòng)脈組織鈣含量，激發(fā)和散發(fā)波長分別為485 nm和520 nm。

(4)腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達(dá)：采用實(shí)時(shí)PCR(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle aorta，α-SMA)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)強(qiáng)度。利用試劑盒提取總RNA，然后對RNA進(jìn)行電泳。反轉(zhuǎn)錄后實(shí)施RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性共2 min，95 ℃變性共15 s，60 ℃水浴共60 s，60 ℃退火45 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行分析，測得Ct值，以2-ΔΔCt為目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對照組。

(5)腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)：采用蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)法。腹主動(dòng)脈勻漿滅活后提取總蛋白，定量后電泳，封閉孵育(室溫)。1 h后滴加一抗，孵育過夜(4 ℃)，沖洗后滴加二抗，孵育2 h(37 ℃)，再次沖洗。顯色并以純化水終止反應(yīng)，暗室曝光、顯影。拍照并計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，組內(nèi)差異比較采用配對t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

32只大鼠中共有30只建模成功，隨機(jī)分為模型對照組(8只)、低劑量組(7只)、中劑量組(7只)和高劑量組(8只)，干預(yù)期間分別有1只、1只、1只、0只死亡，正常對照組實(shí)驗(yàn)期間無大鼠死亡。干預(yù)前模型對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組的24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮水平均高于正常對照組(P<0.05)，干預(yù)后正常對照組均無顯著變化(P>0.05)，模型對照組均顯著升高(P<0.05)，3劑量組均顯著降低(P<0.05)，且干預(yù)后3劑量組均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，其中高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)。(表1)

二、各組大鼠腹主動(dòng)脈鈣化情況觀察及腹主動(dòng)脈組織鈣含量比較

正常對照組大鼠腹主動(dòng)脈組織未見鈣鹽沉積，其余4組血管內(nèi)膜和中膜彈性纖維間存在較多的、散在點(diǎn)狀沉積棕褐色鈣鹽顆粒。其中模型對照組鈣化特征最為明顯，可見大范圍融合的鈣化斑塊；低劑量組次之，可見部分鈣化斑塊或較大顆粒的鈣鹽；中劑量組稍輕，可見鈣鹽顆粒；高劑量組鈣化特征最輕，鈣鹽顆粒較少，與正常對照組最為接近。(圖1)

表1 干預(yù)前后各組大鼠腎功能指標(biāo)比較

注：與同組干預(yù)前對比，aP<0.05；與正常對照組對比，bP<0.05；與模型對照組對比，cP<0.05；與低劑量組對比，dP<0.05；與中劑量組對比，eP<0.05

圖1 各組大鼠腹主動(dòng)脈鈣化情況觀察(×200) A.正常對照組；B.模型對照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

各組大鼠腹主動(dòng)脈組織鈣含量對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3劑量組均高于正常對照組(P<0.05)，且均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組低于低劑量組(P<0.05)。(表2)

表2 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織鈣含量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

三、各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達(dá)量比較

各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA表達(dá)對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中3劑量組表達(dá)均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)，α-SMA mRNA表達(dá)情況剛好相反。(表3)

四、各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)量比較

各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2蛋白表達(dá)量對比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中3劑量組表達(dá)均高于正常對照組(P<0.05)，均低于模型對照組(P<0.05)，高劑量組均低于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，中劑量組均低于低劑量組(P<0.05)，α-SMA蛋白表達(dá)情況剛好相反。(圖2、表4)

表3 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA表達(dá)量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

表4 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)量比較

注：與正常對照組對比，aP<0.05；與模型對照組對比，bP<0.05；與低劑量組對比，cP<0.05；與中劑量組對比，dP<0.05

圖2 各組大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)量western blot檢測結(jié)果

討 論

糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化主要是由于血糖長期處于較高水平，導(dǎo)致微血管、神經(jīng)病變等，使得血管彈性降低，血管壁受損，加之隨著年齡的增長血管逐漸老化而形成的[6-8]。主動(dòng)脈鈣化會(huì)使血管僵硬度增加，血管彈性和順應(yīng)性減弱，脈壓增加，左心室負(fù)荷增大，進(jìn)而可導(dǎo)致左心室肥厚，還可誘發(fā)并逐漸加重冠狀動(dòng)脈缺血狀態(tài)，誘發(fā)冠心病、心力衰竭等心血管疾病，甚至危及患者的生命安全[9]。有研究表明[10]，主動(dòng)脈鈣化的常見危險(xiǎn)因素有糖尿病腎病、鈣磷代謝紊亂、年齡增長和透析齡增加，目前仍缺乏行之有效的治療方案，因此探討糖尿病主動(dòng)脈鈣化的理想控制方案及其治療作用機(jī)制，符合臨床患者的迫切需求。

本次研究顯示，與正常對照組相比較，模型對照組24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮均升高，3劑量組也均升高，且3劑量組指標(biāo)水平均低于模型對照組，表明對糖尿病腎病鈣化大鼠模型給予大黃酸干預(yù)能夠發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用；其中，高劑量組的效果最佳，表明該藥物的腎保護(hù)作用呈劑量依賴性。此外，模型對照組大鼠腹主動(dòng)脈鈣化較嚴(yán)重，而3劑量組均明顯減輕，且高劑量組鈣化情況最輕，可知大黃酸能夠減輕糖尿病腎病鈣化大鼠模型的腹主動(dòng)脈鈣化情況，且高劑量大黃酸的效果更佳，關(guān)于腹主動(dòng)脈組織鈣含量的檢測結(jié)果也證實(shí)了此結(jié)論。大黃酸是從大黃干燥的根莖中提取的有效成分，而大黃具有利濕退黃、清熱瀉火、涼血解毒的功效[11]。大黃酸也被證實(shí)能夠延緩糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程，保護(hù)腎功能[12]。大黃酸能夠控制腎小球系膜細(xì)胞的增殖，控制腎纖維化，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少尿蛋白，因此對糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化大鼠有良好的保護(hù)腎功能的作用[12]。有研究顯示[13]，大黃酸能夠預(yù)防心血管并發(fā)癥，推測與其能夠控制氧化應(yīng)激并減輕血管壁損傷有關(guān)。但是關(guān)于大黃酸對糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

本次研究顯示，與正常對照組相比較，模型對照組Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA表達(dá)和蛋白相對表達(dá)量均顯著升高，且3劑量組均明顯高于正常對照組，低于模型對照組，3劑量組間相比較，低劑量組Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均最高，中劑量組均次之，高劑量組均最低，α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)情況相反，可知大黃酸能夠調(diào)節(jié)糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化大鼠腹主動(dòng)脈組織Notch1、RBP-JK、Msx2、α-SMA、Runx2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。Notch1-RBP-JK/Msx2是經(jīng)典的主動(dòng)脈鈣化信號傳導(dǎo)調(diào)控通路，在此通路上，Notch1能夠正向調(diào)控RBP-JK和Msx2，且α-SMA、Runx2的表達(dá)均受該信號通路的調(diào)控[14-16]，當(dāng)該信號通路受到刺激被激活，Notch1、RBP-JK、Msx2表達(dá)增強(qiáng)，其下游的α-SMA也可被激活，而Runx2則可受到抑制，參與主動(dòng)脈鈣化病變過程。在高磷、高糖的環(huán)境下和炎癥因子的刺激作用下，Notch1、RBP-JK、Msx2等成骨轉(zhuǎn)錄因子的基因和蛋白的表達(dá)均活化，進(jìn)而誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成骨細(xì)胞，并刺激礦化的發(fā)生。Msx2被認(rèn)為是主動(dòng)脈鈣化的關(guān)鍵調(diào)控因子，已經(jīng)被確認(rèn)屬于成骨分化和礦化的同源轉(zhuǎn)錄因子[17]。在此信號通路傳導(dǎo)過程中，α-SMA、Runx2等成骨因子均積極參與，其中α-SMA屬于平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)水平降低意味著血管平滑肌功能受損[18]；Runx2具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在前成骨細(xì)胞、前軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和前肥大軟骨細(xì)胞中表達(dá)，能夠促進(jìn)成骨轉(zhuǎn)化和骨形成[19]。有報(bào)道顯示，在糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化發(fā)生和發(fā)展的過程中，Notch1-RBP-JK/Msx2信號通路參與其中并發(fā)揮極大的作用，影響病情發(fā)展[20]。結(jié)合本研究結(jié)果推測大黃酸能夠下調(diào)Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)，上調(diào)α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮減輕糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化。但是關(guān)于大黃酸對上述基因和蛋白的具體調(diào)控機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道，仍需深入探討。

綜上所述，大黃酸能夠保護(hù)糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化大鼠的腎功能，減輕主動(dòng)脈鈣化，減少主動(dòng)脈組織的鈣含量，推測其作用機(jī)制與下調(diào)Notch1、RBP-JK、Msx2、Runx2 mRNA及蛋白表達(dá)，上調(diào)α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為糖尿病腎病主動(dòng)脈鈣化的治療藥物研究提供了新的方向，顯示出良好的研究價(jià)值和發(fā)展前景，而該藥物對上述基因和蛋白表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。