涉及主動脈瓣鈣化的潛在易感基因的生物信息學(xué)分析

張丁文， 劉霖如， 呂磊， 吳宗呂， 李昊天， 唐攀力， 易斌， 楊淞然，華平*

目前，主動脈瓣狹窄（AS）在中老年人群中的患病率逐年增加，65歲及以上的人口中約有26%存在主動脈瓣硬化，其中2%至7%的人群存在明顯的AS［1］。組織學(xué)的證據(jù)提示主動脈瓣鈣化導(dǎo)致的狹窄是心臟瓣膜病中AS最主要病因［2］。研究表明，AS疾病早期有著與動脈粥樣硬化類似的致病過程，且有著共同的危險因素，如吸煙、高脂血癥、高血壓和糖尿病等［3］。不同的是，鈣沉積、新生血管的形成和慢性炎癥反應(yīng)似乎是鈣化瓣膜病變最后階段的病理學(xué)特征。由于家族性高膽固醇血癥的患者主動脈瓣鈣化患病率和嚴(yán)重程度遠(yuǎn)高于非家族性高膽固醇血癥患者［4］，基于此，人們預(yù)防性地使用降脂類藥物試圖緩解AS的進(jìn)展。然而，常規(guī)用于治療冠脈粥樣硬化的他汀類藥物并不能有效的緩解AS的疾病進(jìn)展［5?7］。截止目前，外科主動脈瓣置換術(shù)仍然是治療該疾病最為有效的方法，但對于老年人、一般狀況差以及合并多器官病變者，手術(shù)風(fēng)險及術(shù)后死亡率仍較高。因此，迫切需要針對該疾病有效的治療措施。

隨著對疾病研究的逐漸深入，AS的致病過程已被視為涉及多種促炎因子參與的動態(tài)過程，包括：脂質(zhì)和炎性細(xì)胞浸潤；成纖維細(xì)胞的增殖［8］。其中，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（VICs）的表型轉(zhuǎn)變被認(rèn)為是驅(qū)動AS發(fā)展的關(guān)鍵步驟。既往的研究證據(jù)顯示，在鈣化的主動脈瓣膜組織中，VICs的激活使得骨標(biāo)志物如骨橋蛋白、骨黏連蛋白、Runx2/Cbfa1和APL的表達(dá)增加［9，10］。Jonathan等人的研究鑒定染色體16q22.1?q22.3與主動脈瓣鈣化具有緊密聯(lián)系，這提示遺傳因素作用下的基因調(diào)控對AS的致病有重要的意義［11］。與此同時，F(xiàn)ATIH等人的研究首次證明血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）插入/缺失基因型與主動脈瓣鈣化的嚴(yán)重程度有關(guān)，這種影響可能歸因于ACE的表達(dá)增加［12］。由此可見，遺傳因素在AS的致病過程有一定的生物學(xué)意義，但目前研究尚存局限。因此，本研究中我們通過分析基因芯片數(shù)據(jù)，試圖發(fā)現(xiàn)主動脈瓣鈣化相關(guān)的潛在易感基因，為后續(xù)研究尋找潛在治療靶點提供數(shù)據(jù)分析的支持。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)處理

GSE83453是基于平臺GPL10558 Illumina Hu?manHT?12 V4.0生成的，并通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取。GSE83453芯片包含27個主動脈瓣標(biāo)本，包括10例雙尖瓣主動脈瓣標(biāo)本，9例主動脈瓣狹窄和8例對照組?；跀?shù)據(jù)的臨床信息，我們將組織分型中存在鈣化的樣本納入主動脈瓣鈣化組，未存在鈣化的樣本納入作為對照組。其中，二葉主動脈瓣和主動脈狹窄均納入試驗組（N=19），其余的屬于對照組（N=8）。

Affy和 AffyPLM R 數(shù)據(jù)包（https：//cran.r?proj?ect.org/）用于預(yù)處理下載的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過背景校正，歸一化和log2轉(zhuǎn)換后得到基因探針表達(dá)矩陣。在該矩陣中，每一行代表探針，每一列代表樣品。由于生成的表達(dá)矩陣以探針表達(dá)量的形式表示每個樣品中基因的表達(dá)。差異基因分析是通過R自帶的limma程序包計算的，并界定|logFC|＞1，P＜0.05。

1.2 功能及通路富集分析

基因的功能和途徑富集分析有助于從功能學(xué)角度鑒定基因參與的生物學(xué)過程，基于DAVID在線基因功能注釋數(shù)據(jù)庫，將DEG與數(shù)據(jù)庫中已有的生物學(xué)過程進(jìn)行匹配。既往研究表明，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞參與的成骨表型的轉(zhuǎn)化是主動脈瓣鈣化最主要的發(fā)生機(jī)制；與此同時，病理學(xué)證據(jù)表明在主動脈瓣狹窄的病變處存在鈣質(zhì)的異常堆積，這提示鈣離子代謝異常可能參與主動脈瓣鈣化引起的狹窄［2］。因此，我們有目的性地篩選涉及成骨過程及鈣離子代謝過程，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。與此同時，我們對所有的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，并篩選了可能參與的所有代謝通路，以P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)意義。我們將生物學(xué)過程中顯著富集的基因與通路分析中的全部基因進(jìn)行比對，找到生物學(xué)過程富集基因參與的代謝通路。并認(rèn)為這些基因可能是通過某一代謝通路參與該生物學(xué)過程。

1.3 基因間互作網(wǎng)絡(luò)分析

STRING（https：//string?db.org/）是一種在線生物學(xué)分析工具，可用于構(gòu)建基因或蛋白質(zhì)之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)?；诖?，我們分別將全部差異基因以及生物學(xué)過程中顯著富集的基因?qū)氩?gòu)建基因分子間互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，以期從“宏觀“和“微觀“兩種角度展示基因間的相互作用。結(jié)果導(dǎo)入至Cy?toscape（https：//cytoscape.org/）實現(xiàn)基因間互作網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.4 基因?疾病關(guān)聯(lián)預(yù)測

為了進(jìn)一步詮釋基因與心血管疾病的關(guān)聯(lián)，通過CTD數(shù)據(jù)庫預(yù)測已知基因與疾病之間的關(guān)聯(lián)。我們將篩選的基因?qū)隒TD數(shù)據(jù)庫分析基因及產(chǎn)物與心血管疾病之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)這些基因與多種心血管疾病高度相關(guān)，并報告了與這些基因有關(guān)的前五種心血管疾病。

2 結(jié)果

2.1 差異分析結(jié)果

基因芯片數(shù)據(jù)GSE83453中，鈣化組樣本19例，對照組樣本8例。借助R中的limma程序包實現(xiàn)差異分析，總共鑒定出133個差異表達(dá)基因，包括82個下調(diào)基因和51個上調(diào)基因。

2.2 GO和KEGG功能富集分析結(jié)果

GO富集分析最終確認(rèn)參與成骨細(xì)胞分化（富集倍數(shù)：9.49，P：9.18E?05），骨骼系統(tǒng)發(fā)育（富集倍數(shù)：7.20，P：4.12E?04）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002）三個生物學(xué)過程的共16個基因。

通路的富集分析結(jié)果表明，ECM?受體相互作用（富集倍數(shù)：14.16，P：4.23E?10），粘著斑（富集倍數(shù)：5.98，P：3.37E?06），PI3K?Akt信號通路（富集倍數(shù)：4.16，P：1.85E?05），蛋白質(zhì)的消化吸收（富集倍數(shù)：9.33，P：1.86E?05），阿米巴病（富集倍數(shù)：7.74，P：6.24E?05），細(xì)胞因子?細(xì)胞因子受體相互作用（富集倍數(shù)：3.80，P：0.002），NF?κB信號通路（富集倍數(shù)：5.90，P：0.009），補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)（富集倍數(shù)：5.95，P：0.02）和癌癥的途徑（富集倍數(shù)：2.35，P：0.03）代謝途徑具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過比對，得到基因SPP1和COL5A2。

基因SPP1參與成骨細(xì)胞分化（富集倍數(shù)：9.49，P：9.18E?05）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002）的生物學(xué)過程，參與的代謝通路有ECM?受體相互作用（富集倍數(shù)：14.16，P：4.23E?10），粘著斑（富集倍數(shù)：5.98，P：3.37E?06），PI3K?Akt信號通路（富集倍數(shù)：4.16，P：1.85E?05）。

COL5A2參與的生物學(xué)過程有骨骼系統(tǒng)發(fā)育（富集倍數(shù)：7.20，P：4.12E?04）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002），參與的代謝通路有ECM?受體相互作用（富集倍數(shù)：14.16，P：4.23E?10），粘著斑（富集倍數(shù)：5.98，P：3.37E?06），PI3K?Akt信號通路（富集倍數(shù)：4.16，P：1.85E?05），蛋白質(zhì)的消化吸收（富集倍數(shù)：9.33，P：1.86E?05），阿米巴病（富集倍數(shù)：7.74，P：6.24E?05）。

2.3 基因間互作網(wǎng)絡(luò)建立

將主動脈瓣鈣化組和對照組差異表達(dá)的基因批量導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因間的互作網(wǎng)絡(luò)。同時，我們將參與成骨細(xì)胞分化（富集倍數(shù)：9.49，P：9.18E?05），骨骼系統(tǒng)發(fā)育（富集倍數(shù)：7.20，P：4.12E?04）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002）三個生物學(xué)過程的共16個基因?qū)胫罶TRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建這些功能基因間的互作網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果導(dǎo)入至Cytoscape實現(xiàn)基因互作網(wǎng)絡(luò)的可視化。其中，每個節(jié)點代表一個基因，邊代表基因之間的相互作用。節(jié)點間的連線越多說明基因間功能上的依賴性越強(qiáng)。我們以自由度作為構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)的標(biāo)準(zhǔn)，通過節(jié)點的大小及顏色反應(yīng)互作關(guān)系，其中節(jié)點大小越大，顏色越趨近于藍(lán)色提示自由度越高，在基因的互作中發(fā)揮的作用越大。反之，則基因互作越小。我們發(fā)現(xiàn)，基因SPP1和COL5A2與其他基因的關(guān)聯(lián)較為密切。

SPP1參與的生物學(xué)過程和KEGG通路

COL5A2參與的生物學(xué)過程和KEGG通路

2.4 基因?疾病關(guān)聯(lián)預(yù)測

CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）是一個用于預(yù)測基因?疾病關(guān)聯(lián)的網(wǎng)站。通過將SPP1和COL5A2與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)了與SPP1、COL5A2高度相關(guān)的心血管疾病，并使用推斷評分值顯示這種關(guān)聯(lián)。較高的分值表示較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。在這里，我們篩選了與關(guān)鍵基因產(chǎn)物相關(guān)的前五種疾病。

3 討論

瓣膜性心臟病是全球范圍內(nèi)最為流行的心血管疾病之一，在歐美國家，風(fēng)濕性心臟病導(dǎo)致的AS發(fā)病率逐漸下降，退行性心臟病的發(fā)病率卻逐年上升，已成為導(dǎo)致主動脈瓣狹窄最主要的病因。在發(fā)展中國家，風(fēng)濕性心臟病依然是引起AS發(fā)病率上升的主要病因［13］。由于早期患者個體差異大，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，早期篩查及診斷陽性率低，一經(jīng)診斷往往合并有嚴(yán)重的器質(zhì)性病變。超聲心動圖作為重要的影像學(xué)手段，為瓣膜病變的嚴(yán)重程度以及疾病的預(yù)后提供了有意義的信息［14，15］。既往的研究顯示，氧化修飾的低密度脂蛋白參與了主動脈瓣鈣化的致病過程，圍繞以抗脂作為早期干預(yù)的藥物研究不斷深入［16］。然而，多中心的隊列研究表明，他汀類藥物并不能有效的緩解AS的疾病進(jìn)展［5?7］，常規(guī)的主動脈瓣置換術(shù)（AVR）以及經(jīng)導(dǎo)管主動脈瓣置換術(shù)（TAVI）仍是AS首選的治療方式［17］。盡管及時有效的臨床診斷和手術(shù)干預(yù)可使絕大多數(shù)中重度主動脈瓣狹窄患者得到救治，但是暴露于危險因素（如吸煙，高脂血癥、高血壓和糖尿病等）下的潛在易感人群隨著病情的進(jìn)展仍有較大的概率進(jìn)展為有癥狀的瓣膜病變［3，18，19］?；诖?，對 AS 致病機(jī)制的研究以及發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點具有重要的意義。

盡管主動脈瓣鈣化領(lǐng)域的臨床研究層出不窮，但基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討主動脈瓣鈣化的潛在易感基因的研究相對較少［20，21］。本研究借助生物信息學(xué)的方法，目的是挖掘與主動脈瓣鈣化相關(guān)的潛在易感基因，為進(jìn)一步研究主動脈瓣鈣化的作用機(jī)制以及尋找潛在的治療靶點提供參考。在數(shù)據(jù)集GSE83453中，我們以是否存在鈣化作為分組的主要依據(jù)，將所有樣本分為主動脈瓣鈣化組和非鈣化組，其中，鈣化組樣本19例，對照組樣本8例。通過差異分析，共鑒定出133個差異表達(dá)基因，包括82個下調(diào)基因和51個上調(diào)基因。這說明在轉(zhuǎn)錄組層面上，這些基因在鈣化的瓣膜組織和非鈣化的瓣膜組織中存在表達(dá)上的差異。但是，單純的差異分析只能說明基因表達(dá)量上的差異，并不詮釋這些基因及其蛋白產(chǎn)物在功能上的作用。因此，我們進(jìn)一步對這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能學(xué)上的分析，目的是為了從功能上去探索這些基因可能參與調(diào)控的生物學(xué)過程。借助DAVID功能注釋分析數(shù)據(jù)庫，我們將133個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，總共篩選出82個有統(tǒng)計學(xué)意義的功能注釋和代謝通路。既往的研究表明，多種因素介導(dǎo)的異位骨化以及鈣磷代謝異常是導(dǎo)致主動脈瓣硬化的生物學(xué)基礎(chǔ)。隨著疾病的不斷進(jìn)展，鈣化的主動脈瓣葉逐漸硬化，最終演變成AS，產(chǎn)生呼吸困難、暈厥和心絞痛等臨床癥狀［18，22］?；诖?，我們有目的的對功能富集分析的結(jié)果進(jìn)行篩選，選取成骨細(xì)胞分化（富集倍數(shù)：9.49，P：9.18E?05），骨骼系統(tǒng)發(fā)育（富集倍數(shù)：7.20，P：4.12E?04）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002）三個生物學(xué)過程的共16個基因作為感興趣的基因。然后，我們將上述基因與代謝通路中富集的基因進(jìn)行比對，目的是了解具有上述功能的基因是否在代謝通路中存在顯著富集，得到基因SPP1和COL5A2。

分 泌 磷 蛋 白 1（secreted phosphoprotein 1，SPP1）又名骨橋蛋白（OPN），是成骨細(xì)胞特異性的標(biāo)志物。Nalini M等人的研究發(fā)現(xiàn)，在鈣化的主動脈瓣膜組織中，成骨細(xì)胞和骨標(biāo)志物如骨橋蛋白、骨唾液蛋白、骨鈣蛋白、堿性磷酸酶和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Cbfa1表達(dá)量明顯增加，從而支持了主動脈瓣的鈣化過程可能有成骨相關(guān)的調(diào)控過程［23］。既往研究表明，主動脈瓣鈣化導(dǎo)致的狹窄取決于形成成骨表型的成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的存在，而在鈣化的瓣膜中與成骨細(xì)胞功能密切相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這其中就包括骨橋蛋白［24］。本研究中，我們對SPP1進(jìn)行功能注釋及代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)SPP1參與成骨細(xì)胞分化（富集倍數(shù)：9.49，P：9.18E?05）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002）的生物學(xué)過程，參與的代謝通路有ECM?受體相互作用（富集倍數(shù)：14.16，P：4.23E?10），粘著斑（富集倍數(shù)：5.98，P：3.37E?06），PI3K?Akt信號通路（富集倍數(shù)：4.16，P：1.85E?05）。其參與的生物學(xué)過程與既往的研究相一致。膠原蛋白Vα2鏈（collagen type V alpha 2 chain，COL5A2）是我們篩選得到的另一個潛在的易感基因，目前尚未發(fā)現(xiàn)足夠的文獻(xiàn)支持其在主動脈瓣鈣化致病過程中的作用。基于對COL5A2的功能分析的結(jié)果顯示，基因COL5A2主要參與的生物學(xué)過程有骨骼系統(tǒng)發(fā)育（富集倍數(shù)：7.20，P：4.12E?04）和骨化（富集倍數(shù)：8.81，P：0.002），參與的代謝通路有ECM?受體相互作用（富集倍數(shù)：14.16，P：4.23E?10），粘著斑（富集倍數(shù)：5.98，P：3.37E?06），PI3K?Akt信號通路（富集倍數(shù)：4.16，P：1.85E?05），蛋白質(zhì)的消化吸收（富集倍數(shù)：9.33，P：1.86E?05），阿米巴病（富集倍數(shù)：7.74，P：6.24E?05）。通過功能注釋的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)COL5A2參與了成骨的代謝過程，這對于深入探討COL5A2在瓣膜鈣化的調(diào)控作用提供了數(shù)據(jù)分析上的支撐。

本項研究結(jié)果表明，SPP1和COL5A2可能是參與主動脈瓣鈣化的潛在易感基因，為后續(xù)探討主動脈瓣鈣化具體作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持。