基于表達和反應耦聯(lián)的羥基化酶催化合成反式-4-羥基-L-脯氨酸

景曉冉，聶 堯，徐 巖，2

(1.江南大學 生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗，江蘇無錫214122；2.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hpro)是藥物合成中一種重要的中間體[1-3]，可以用來合成碳青霉烯類抗生素類高附加值藥物[4-5]，同時在材料化工、食品營養(yǎng)和護膚美容方面也具有廣泛的應用價值[6-7]。目前，隨著生物技術的快速發(fā)展，生物合成trans-4-Hpro的研究引起人們的廣泛關注。

1995年，Serizawa等[8]發(fā)現(xiàn)一株可被命名為ClonostachyscylindrosporaSANK 14591的菌株，外源添加L-脯氨酸(L-Pro)可以合成13.8 mg/L的trans-4-Hpro。1996年，Lawrence等[9]從StreptomycesgriseoviridusP8648 中純化出脯氨酸4-羥化酶，并對該酶的特性進行了初步研究，每毫克蛋白每分鐘的羥脯氨酸產(chǎn)量僅為907 pmol/L。2000年，Shibasaki等通過全細胞酶活測定篩選出來源于Dactylosporangiumsp. RH1活性最高的P4H[10]，以Escherichiacoli(E.coli)W1485 作為宿主菌進行重組表達，并以E.coliW1485 pTrS2-4OH為菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中外源添加L-Pro獲得了15 g/L的trans-4-Hpro[11]。2006年，Bontoux等[12]在反應體系中添加10 mmol/L的L-Pro為底物，在250株野生菌中篩選出5株可轉化生成trans-4-Hpro，產(chǎn)率均在5%～10%。2013年，劉合棟等[13]將優(yōu)化后的P4H基因插入含有色氨酸串聯(lián)啟動子的pUC19 質粒，并導入E.coliBL21(DE3)中，在搖瓶水平添加200 mmol/L L-Pro為底物發(fā)酵8 h，可積累0.492 g/L 的trans-4-Hpro。2017年，周海巖等[14]將源于BradyrhizobiumjaponicumUSDA 6的脯氨酸4-羥化酶在E.coliBL21(DE3)中進行重組構建，采用全細胞催化反應體系，經(jīng)過體系的優(yōu)化，trans-4-Hpro的合成量達到34.86 mg/L。

雖然目前已有許多生物催化轉化羥基脯氨酸研究的相關報道，但能夠高效羥基化L-Pro的酶資源仍然有限。微生物合成法生產(chǎn)trans-4-Hpro的過程中，菌體生長緩慢，很難達到高密度發(fā)酵，L-Pro的有效轉化率較低，從而造成生產(chǎn)原料的浪費。本研究中，筆者利用功能酶基因探礦方法挖掘獲得羥基化L-Pro的新型Fe(II)/2-酮戊二酸(2-OG)依賴型雙加氧酶KaPH1，對羥基化酶表達和反應耦聯(lián)過程進行調控，通過監(jiān)測體系中菌體生長、蛋白表達及底物轉化進程，以期實現(xiàn)在不添加共底物2-OG的情況下L-Pro的高效轉化，為生物合成trans-4-Hpro高效轉化體系的建立提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Kutzneriaalbida(白色庫茨涅爾氏菌)，中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)；E.coliJM109和E.coliBL21(DE3)保存于本實驗室；表達載體pET-28a，Novagen公司；克隆載體pMD-19T、限制性內(nèi)切酶和連接酶，TaKaRa公司；PCR純化試劑盒、DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒，OMEGA生物科技公司；E.colipET-28a-KaPH1(E.coliKaPH1)、E.colipET-28a-P4H(E.coliP4H)本研究中構建；標準品L-Pro、trans-4-Hpro、順式-4-羥基-L-脯氨酸(cis-4-Hpro)，美國Sigma 公司；卡那霉素、IPTG，上海生工生物技術有限公司；其他分析純試劑，國藥集團化學試劑有限公司；PCR引物、P4H的基因序列由上海睿迪生物科技有限公司合成。

Mastercycler nexus X2型PCR儀，Eppendorf公司；GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；酶標儀，Thermo公司；pH計，美國Mettler Toledo公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC-MS/MS液質聯(lián)用儀，沃特世科技有限公司；Avance 400型核磁共振波譜儀，Bruker公司；JY-IIN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物公司；UV-3102PC型分光光度儀，美國UNIC公司；Avanti J-E型冷凍高速離心機，Beckman Coulter公司。

1.2 實驗過程

1.2.1 目的基因片段的獲得

參照大腸桿菌密碼子偏好性、GC含量，對來源于Dactylosporangiumsp.的脯氨酸4-羥基化酶基因(P4H，GenBank No.BAA20094.1)進行序列的優(yōu)化和設計，將合成的基因片段連接到表達載體pET-28a中。

利用基因挖掘工具，將已報道的P4H在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進行同源序列比對后，選取與其序列同源性為51%的基因作為候選基因進行重組克隆表達。以Kutzneriaalbida的全基因組為模板，以KaPH1-F-NdeⅠ(5’-T￣G￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣C￣T￣C￣A￣C￣C￣G￣A￣T￣T￣C￣G￣C￣A￣G￣T-3)和KaPH1-R-HindⅢ(5’-T￣T￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣G￣C￣G￣C￣C￣C￣A￣G￣G￣C-3’)為引物，擴增目的片段KaPH1。PCR反應體系：ddH2O 22 μL，引物F(50 pmol/μL) 1 μL，引物R(50 pmol/μL) 1 μL，基因組DNA 1 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL。PCR反應過程：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 10 s，47 ℃ 5 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。用PCR純化試劑盒純化DNA片段，將獲得的基因片段連接到克隆載體pMD-19T中。

1.2.2 重組菌株的構建

用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、HindⅢ對克隆載體pMD-19T-KaPH1和表達載體pET-28a分別進行雙酶切，回收目的片段用T4 DNA連接酶于20 ℃過夜連接，轉化E.coliJM109 感受態(tài)細胞中，涂布含50 μg/mL 卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)12 h；挑取陽性克隆子，經(jīng)菌落PCR和DNA測序驗證正確后，將重組質粒pET-28a-P4H、pET-28a-KaPH1分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，構建重組菌E.coliP4H和E.coliKaPH1。

1.2.3 重組大腸桿菌的培養(yǎng)和誘導表達

挑取重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，并以2%的接種量轉接至50 mL 含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，為了探究重組菌株目的蛋白最優(yōu)的表達條件，設置添加的IPTG濃度為0.1、0.5和1.0 mmol/L，并將誘導溫度分別設置為20、25和30 ℃，于200 r/min 下誘導培養(yǎng)12 h后通過SDS-PAGE檢驗蛋白可溶性表達情況[15]。

1.2.4 全細胞酶活測定方法

酶活測定體系(mmol/L)：葡萄糖20，L-Pro 20，L-抗壞血酸5，2-OG 20，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，MgSO47H2O 2，CaCl20.5；加入一定量的全細胞，在28 ℃、200 r/min條件下反應30 min，測定體系中trans-4-Hpro的生成量。

酶活定義：在28 ℃下，1 min生成1 mmol/Ltrans-4-Hpro所需要的全細胞的量定義為一個酶活單位(U)。

1.2.5E.coliKaPH1轉化合成trans-4-Hpro

全細胞反應體系(mmol/L)：葡萄糖20，L-Pro 20，L-抗壞血酸5，2-OG 20，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，MgSO4·7H2O 2，CaCl20.5，菌體質量分數(shù)5%，初始 pH 7.0。將經(jīng)過誘導培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心，稱取濕菌體質量，然后用MES緩沖液將細胞沖洗懸浮后，在28 ℃搖床中200 r/min培養(yǎng)24 h，然后在沸水中加熱2 min，滅活菌體，終止酶反應，測定體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量[16]。

分別在不同溫度梯度(20、25、30、35、40和50 ℃)和pH梯度下測定重組菌E.coliKaPH1全細胞活性，探究反應體系的溫度和pH對trans-4-Hpro合成的影響。不同pH梯度的反應體系分別采用100 mmol/L MES-Tris緩沖液(pH 3.5～7)和100 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7～9)。

分別在不同2-OG濃度梯度(0～45 mmol/L)、Fe2+濃度梯度(0～3.5 mmol/L)和L-抗壞血酸濃度梯度(0～30 mmol/L)下測定重組菌E.coliKaPH1轉化體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量，探究轉化體系中共底物和輔因子對trans-4-Hpro合成的影響。

考察轉化體系中的葡萄糖濃度(0～50 mmol/L)和CaCl2濃度(0～4 mmol/L)對重組菌E.coliKaPH1轉化L-Pro活性的影響。

1.2.6 表達和反應耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的過程調控

取重組大腸桿菌單菌落接種至5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)過夜，并以6%的接種量轉接至50 mL 含50 mg/L卡那霉素的自誘導液體培養(yǎng)基(添加一定濃度的L-Pro)的500 mL擋板錐形瓶中，于37 ℃、225 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h后，于20 ℃、225 r/min培養(yǎng)80 h，將發(fā)酵液離心，測定發(fā)酵上清中trans-4-Hpro的產(chǎn)量[16]。

對體系中產(chǎn)酶和催化耦聯(lián)過程進行溫度階段性調控，在誘導培養(yǎng)時分別控制表達和轉化最適溫度條件的時間，確定最優(yōu)調控途徑。

在不同誘導劑濃度(10～30 mmol/L乳糖)下測定trans-4-Hpro的產(chǎn)量及全細胞的酶活，考察乳糖濃度對重組菌株E.coliKaPH1合成trans-4-Hpro的影響。

對耦聯(lián)轉化體系中底物 L-Pro設置濃度梯度(20～100 mmol/L)，考察體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量和生物量(OD600)的變化，以分析底物濃度的增加對重組菌株E.coliKaPH1生長和轉化L-Pro活性的影響。

1.2.7 底物和產(chǎn)物的分析

使用芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)柱前試劑對樣品進行衍生化反應[17]，終止反應后用于HPLC 檢測。底產(chǎn)物的分析方法：Diomansil C18 柱(250 mm×4.6 mm)，紫外檢測波長263 nm，流動相A 為(0.05 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.2)與乙腈的體積比90∶ 10)，流動相B 為(0.05 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.2)與乙腈的體積比20∶ 80)，流動相A和流動相B采用梯度洗脫程序，流速1.0 mL/min。

1.2.8 產(chǎn)物結構鑒定

采用液相色譜-質譜( LC-MS)聯(lián)用技術及核磁共振儀(NMR) 對反應產(chǎn)物進行結構表征。LC-MS 條件：采用液質聯(lián)用儀Waters ACQUITY UPLC-MS/MS系統(tǒng)，色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS C18反相色譜柱(1.8 μm)。流動相A為0.02 mol/L NH4Ac-HAc緩沖液(pH 4.2)，流動相B為乙腈，進行梯度洗脫。流速200 μL/min，柱溫 25 ℃，進樣量 5 μL。將10 mg的產(chǎn)物粉末溶于600 μL D2O后，轉移至直徑為5 mmol/L核磁管。由核磁共振波譜儀測定核磁共振氫譜(1H NMR)和碳譜(13C NMR)[18]，反應產(chǎn)物核磁數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 化合物的核磁共振氫譜及碳譜分析

2 結果與討論

2.1 羥基化酶的表達及其催化合成轉化trans-4-Hpro

在前期研究工作中，筆者利用基因挖掘工具基于已報道的P4H序列通過同源序列比對獲得K.albida來源的新型羥基化酶KaPH1(GenBank No.WP_030110684.1)，并對其酶學性質進行了測定[19]。功能性驗證試驗表明KaPH1可將L-Pro高效地立體選擇性羥基化形成trans-4-Hpro，KaPH1純化后的蛋白條帶大小約為2.9×104，其最適pH為6.5，最適溫度為30 ℃；以L-Pro為底物，其Km和kcat值分別為1.07 mmol/L和 0.54 s-1[19]。在本研究中，筆者進一步對重組菌E.coliKaPH1的表達條件進行探究，結果如圖1所示。由圖1可見，E.coliKaPH1在分子量3×104處發(fā)現(xiàn)一條明顯的條帶，與目標條帶分子量大小一致。通過對E.coliKaPH1表達條件優(yōu)化，結果表明：KaPH1在25和30 ℃條件下蛋白的總表達量較高，但是在上清中無法觀察到明顯目的條帶，大部分呈現(xiàn)為包涵體的形式；相比之下，KaPH1在20 ℃條件下雖然蛋白的總表達量較少，但可溶性表達效果最好。在考察的IPTG濃度(0.1、0.5、1 mmol/L)下，E.coliKaPH1均可表達可溶性的KaPH1，0.5和1 mmol/L IPTG條件下誘導的蛋白表達量一致且明顯高于0.1 mmol/L IPTG濃度下的蛋白表達量。由此確定E.coliKaPH1最適表達條件：20 ℃、0.5 mmol/L IPTG。

(a) M—標準蛋白；1、2—在20 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；3、4—在25 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；5、6—在30 ℃條件下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；(b) 1′、2′—0.1 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；3′、4′—0.5 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白；5′、6′—1 mmol/L IPTG濃度下KaPH1的總蛋白及可溶性蛋白圖1 重組大腸桿菌E.coli KaPH1在不同溫度(a)和IPTG濃度(b)誘導下的異源表達情況Fig.1 Heterologous expression of E.coli KaPH1 induced at different temperature (a) and IPTG concentration (b)

L-Pro的羥基化過程需要分子氧、2-OG和Fe2+等輔因子和共底物的協(xié)同作用[11]，L-Pro的羥基化過程與共底物2-OG的脫羧反應耦聯(lián)進行。本研究采用E.coliKaPH1全細胞轉化體系，通過外源添加底物、共底物和輔因子等，對重組菌轉化L-Pro的活性進行比較分析。

在全細胞體系中加入20 mmol/L的L-Pro作為底物，通過檢測反應體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量來比較重組菌株E.coliKaPH1轉化L-Pro的活性，結果如圖2所示。由圖2可知，在反應前期階段，E.coliKaPH1轉化體系中trans-4-Hpro迅速積累，在反應12 h后臨近反應終點，體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量最終達到1 051 mg/L，轉化率為40.1%；與此同時，對照E.coliP4H菌株反應體系中trans-4-Hpro的積累量也達到825 mg/L，轉化率為31.4%。全細胞反應轉化結果表明，在相同菌體濃度(質量分數(shù)5%)下，重組菌株E.coliKaPH1展現(xiàn)出很高的L-Pro轉化活性。在接下來的研究中，筆者將對E.coliKaPH1轉化體系中影響trans-4-Hpro合成的因素進行探究，并對產(chǎn)酶和催化耦聯(lián)過程進行調控。

圖2 E.coli KaPH1轉化合成trans-4-Hpro的活性驗證Fig.2 Catalytic activity of E.coli KaPH1 for trans-4-Hpro synthesis

2.2 E.coli KaPH1轉化體系調控結果

為探究轉化合成trans-4-Hpro過程中的影響因素，通過對反應條件及轉化體系中各組分的濃度進行調控，檢測E.coliKaPH1活性或體系中trans-4-Hpro產(chǎn)量的變化。

2.2.1 溫度和pH對E.coliKaPH1 活性的影響

為了考察反應溫度及pH對E.coliKaPH1活性的影響，在其他因素不變的條件下，分別設置溫度梯度(20、25、30、35、40和50 ℃)及pH梯度(MES緩沖液pH 3.5～7，Tris-HCl緩沖液pH 7～9)，結果如圖3所示。由圖3可知，在25～40 ℃溫度范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性維持在75%以上，并在30 ℃時達到最高值。在溫度低于30 ℃時，E.coliKaPH1活性隨著溫度的升高逐漸升高；在溫度高于30 ℃時，E.coliKaPH1的活性逐步降低，在50 ℃時，E.coliKaPH1活性損失超過了50%。

在pH 3.5～5.0范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性很低維持在25%以下，E.coliKaPH1活性在pH 5.5時迅速上升，并在pH 6.5時達到最高；在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，E.coliKaPH1活性下降，且活性測定體系的顏色發(fā)生變化(Fe2+在堿性環(huán)境下發(fā)生反應)。綜上，本研究選擇30 ℃和pH 6.5為接下來單步轉化體系的反應條件。

2.2.2E.coliKaPH1轉化體系各組分對trans-4-Hpro合成的影響

圖3 溫度(a)和pH(b)對E.coli KaPH1 活性的影響Fig.3 Effect of temperature (a) and pH (b) on E.coli KaPH1 activity

1)2-OG對trans-4-Hpro合成的影響。Trans-4-Hpro合成是由酶促羥基化反應與2-OG氧化脫羧反應相耦聯(lián)[20]，通過改變反應體系中2-OG的添加量探究其對重組菌的轉化活性及trans-4-Hpro合成的影響。由于2-OG具有極大的酸性，使用Tris將2-OG母液的pH調至7.0再添加至體系中，結果如圖4(a)所示。由圖4(a)可知，當2-OG的濃度在0～30 mmol/L變化時，2-OG對trans-4-Hpro的產(chǎn)生具有顯著的促進作用，在20 mmol/L處產(chǎn)量達到最高，為1 220 mg/L。隨著2-OG濃度的繼續(xù)增加，trans-4-Hpro的產(chǎn)量增長趨勢不明顯，反應體系的pH上升至8.6～8.9，這是由于2-OG在反應過程中不斷被消耗，對反應體系的緩沖影響很大，造成體系pH的變化，從而影響了重組酶KaPH1的活性。

2)Fe2+對trans-4-Hpro合成的影響。Fe2+是2-OG依賴的雙加氧酶的金屬中心與底物相互作用的輔因子，所以Fe2+濃度會對重組酶的活性和羥基化反應有很大的影響[21]。針對全細胞催化系統(tǒng)(底物添加濃度20 mmol/L)，考察反應體系中Fe2+濃度對重組菌轉化活性的影響，結果如圖4(b)所示。由圖4(b)可知，F(xiàn)e2+濃度在0～1.5 mmol/L變化時，對trans-4-Hpro的產(chǎn)生沒有很大影響。隨著Fe2+濃度的繼續(xù)增加，羥脯氨酸的產(chǎn)量逐步上升，在2.5 mmol/L處達到最大產(chǎn)量為1 246 mg/L。因此，F(xiàn)e2+最適添加濃度為2.5 mmol/L。

圖4 E.coli KaPH1轉化體系各組分對L-Pro羥基化的影響Fig.4 Optimization of components in E.coli KaPH1 transformation system for L-proline hydroxylation

3)L-抗壞血酸對trans-4-Hpro合成的影響。Fe2+在水溶液中極易容易被氧化，在針對Fe(II)/2-OG 依賴型雙加氧酶催化機制的研究發(fā)現(xiàn)[21]，該反應過程在某些情況下與抗壞血酸的氧化耦聯(lián)，在體外系統(tǒng)中添加抗壞血酸或其他還原劑對Fe(II)/2-OG 依賴型雙加氧酶具有一定的激活作用[22]。在考察反應體系中L-抗壞血酸濃度對重組菌催化活性的影響時，將L-抗壞血酸濃度設定為0～30 mmol/L。由圖4(c)發(fā)現(xiàn):添加L-抗壞血酸更有利于trans-4-Hpro的合成；添加10 mmol/L抗壞血酸時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量達到最高水平(1 158 mg/L)。隨著L-抗壞血酸濃度的持續(xù)增加，它對轉化系統(tǒng)的緩沖體系也造成很大影響，因此，將L-抗壞血酸濃度設定為10 mmol/L。

4)CaCl2對trans-4-Hpro合成的影響。CaCl2雖然并未直接參與L-Pro的羥基化反應，但CaCl2與菌株細胞膜的通透性有關，從而影響到產(chǎn)物的釋放，避免產(chǎn)物抑制。對轉化體系中的 CaCl2設置 0.5～4.0 mmol/L濃度梯度，所得數(shù)據(jù)結果如圖4(d)所示。由圖4(d)可知,較低濃度的CaCl2對trans-4-Hpro酸的產(chǎn)量有一定程度的提高，在0.5 mmol/L達到最高水平(1 182 mg /L)。

5)葡萄糖對trans-4-Hpro合成的影響。葡萄糖經(jīng)TCA循環(huán)化生成中間代謝產(chǎn)物2-OG[23]，2-OG氧化脫羧反應與L-Pro的羥基化反應相耦聯(lián)，葡萄糖含量會對trans-4-Hpro的合成有一定影響，因此對轉化體系的葡萄糖設濃度梯度，結果如圖4(e)所示。由圖4(e)可知，在添加濃度為0～30 mmol/L的范圍內(nèi)，葡萄糖濃度的升高對L-Pro的羥基化反應較為有利，在30 mmol/L時trans-4-Hpro產(chǎn)量達到最高水平(1 112 mg/L)。但過高的葡萄糖濃度會急劇減少trans-4-Hpro的產(chǎn)生，是因為葡萄糖濃度過高，導致重組菌的代謝副產(chǎn)物乙酸濃度增加[24]，從而對重組菌的轉化活性產(chǎn)生影響。

2.3 表達和反應耦聯(lián)的過程調控

Studier[25]針對表達型質粒自發(fā)誘導問題建立了自誘導表達系統(tǒng)，解決了原核生物高效表達過程中存在的問題。本研究中，筆者采用自誘導培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶表達，在體系中加入L-Pro和其他輔因子，目的是將產(chǎn)酶表達和催化過程進行耦聯(lián)，并對體系進行調控以建立高效發(fā)酵轉化體系(圖5)。

圖5 酶表達與反應耦聯(lián)合成trans-4-HproFig.5 Enzyme expression and reaction coupling system for the synthesis of trans-4-Hpro

2.3.1 表達和反應耦聯(lián)過程的溫度調控

重組酶KaPH1在20 ℃的條件下可溶性表達最好，同時通過全細胞酶活測定確定最適反應溫度為30 ℃?，F(xiàn)在對整個反應過程進行階段性溫度調控，設置底物初始添加濃度為20 mmol/L，然后將反應時間設為80 h，轉化結果如圖6所示。由圖6可知：在溫度調控途徑一條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為1 662 mg/L，產(chǎn)率為63.4%；在溫度調控途徑二條件下，trans-4-Hpro為2 165 mg/L，產(chǎn)率82.6%；在溫度調控途徑三條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 512 mg/L，產(chǎn)率95.8%；在溫度調控途徑四條件下，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 450 mg/L，產(chǎn)率92%。

圖6 耦聯(lián)體系合成trans-4-Hpro的溫度調控Fig.6 Temperature gradient-based regulation of coupling- system for the synthesis of trans-4-Hpro

(a)溫度調控途徑一：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20 ℃誘導培養(yǎng)20 h，將溫度轉為30 ℃反應60 h。(b)溫度調控途徑二：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20 ℃誘導培養(yǎng)40 h，將溫度轉為30 ℃反應40 h。(c)溫度調控途徑三：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20℃誘導培養(yǎng)60 h，將溫度轉為30 ℃反應20 h。(d)溫度調控途徑四：將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h后，變溫為20℃誘導培養(yǎng)80 h。

由圖6結果可知，溫度調控對OD600的積累沒有太大影響，轉化過程中E.coliKaPH1最高OD600均達到15左右。同時，溫度的改變對細胞活性影響很大，其中途徑一、二體系在變溫之后，全細胞活性迅速下降。而在途徑三中，將E.coliKaPH1接入耦聯(lián)體系37 ℃培養(yǎng)3 h，變溫為20 ℃誘導培養(yǎng)60 h后全細胞比酶活仍保持在0.55 U/g，最終將溫度轉為30 ℃反應20 h，產(chǎn)率可達到95.8%。綜上，溫度調控途徑三為有利于trans-4-Hpro的合成。

2.3.2 乳糖濃度對表達和反應耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的影響

重組菌株高密度生長表達異源蛋白，以乳糖作為誘導劑可以提高蛋白表達量，降低生產(chǎn)成本[26]?？疾烊樘菨舛葘Ρ磉_和反應耦聯(lián)合成trans-4-Hpro的影響，結果如圖7所示。由圖7可見，在乳糖為5 g/L時，體系中trans-4-Hpro的產(chǎn)量僅2 802 mg/L，產(chǎn)率為53%。在5～20 g/L的范圍內(nèi)，隨著乳糖濃度的提高，體系中trans-4-Hpro的合成速率及生物量有增長的趨勢，酶活在36 h時達到最高。當乳糖為15 g/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量達到最高為3 782 mg/L，產(chǎn)率為72%；當乳糖提高至25 g/L時，產(chǎn)量、E．coliKaPH1 OD600及比酶活均有所降低。高濃度的乳糖雖然會加快trans-4-Hpro的前期合成速率，但是由于乳糖分解生成的半乳糖無法被大腸桿菌所利用，會造成原料的浪費。綜上，筆者選擇在體系中添加15 g/L的乳糖濃度來誘導合成trans-4-Hpro。

圖7 乳糖濃度對生物合成trans-4-Hpro的影響Fig.7 Effects of lactose concentration on the synthesis of trans-4-Hpro

2.3.3 底物濃度對E.coliKaPH1合成trans-4-Hpro的影響

為進一步探究底物濃度對耦聯(lián)轉化過程的影響，保證體系中其他因素不變的情況下提高L-pro的濃度，檢測體系中trans-4-Hpro的變化，結果如圖8所示。由圖8可知：L-Pro濃度為20 mmol/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為2 223 mg/L，OD600達到20.89，產(chǎn)率為84.8%；L-Pro濃度為40 mmol/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為3 960 mg/L，OD600達到22.14，產(chǎn)率為75.5%；L-Pro濃度為60 mmol/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為4 871 mg/L，OD600達到21.12，產(chǎn)率為60.3%；L-Pro濃度為80 mmol/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為6 007 mg/L，OD600達到23.16，產(chǎn)率56.4%；在培養(yǎng)基中L-Pro濃度為100 mmol/L時，trans-4-Hpro的產(chǎn)量為7 860 mg/L，OD600達到22.82，產(chǎn)率為59.9%。在不同的底物濃度下，耦聯(lián)轉化體系反應過程中中生物量的積累量變化不明顯，隨著底物濃度的升高，OD600有一定的提高。反應終點時，筆者發(fā)現(xiàn)在不同的底物濃度下體系中L-Pro均無剩余，但隨著底物濃度的提高，L-Pro有效轉化率逐步下降。針對E.coliKaPH1高底物濃度下有效轉化率降低和底物的異常消耗現(xiàn)象[27]，還需從代謝角度分析并對菌株進行進一步的工程改造，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。

圖8 底物濃度對trans-4-Hpro的合成及生物量的影響Fig.8 Effects of substrate concentration on the synthesis of trans-4-Hpro and biomass

3 結論

基于已報道的P4H的基因序列，采用功能酶基因探礦方法，挖掘獲得可以高效羥基化L-Pro的新型羥基化酶KaPH1，對E.coliKaPH1轉化體系合成trans-4-Hpro進行過程優(yōu)化，將產(chǎn)量提高了18.5%。為了拓展新酶KaPH1的高效利用，將產(chǎn)酶和催化過程耦聯(lián)并調控，添加100 mmol/L的L-Pro作為底物，有效轉化率可達到60%，OD600可達到20以上。通過過程調控，提高了新酶資源的高效利用，為生物合成trans-4-Hpro高效轉化體系的建立提供理論和實踐基礎。