細胞工廠氧化還原狀態(tài)的熒光探針檢測與調(diào)控

俞 杰，秦 磊，許 可，馮旭東，李 春

(北京理工大學化學與化工學院，北京100081)

氧化還原反應(redox reaction)是一類氧化劑和還原劑之間發(fā)生電子轉移的反應，貫穿細胞的整個生長代謝過程。氧化還原狀態(tài)是表征細胞生理狀態(tài)的一項重要指標。在正常情況下，細胞內(nèi)的氧化還原反應維持在一個平衡狀態(tài)，隨著外界條件的變化或細胞自身的代謝失衡，細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)會發(fā)生改變，細胞內(nèi)活性氧(ROS)大量累積，造成DNA、蛋白質損傷以及脂質過氧化等，影響細胞結構和功能，嚴重情況下會造成細胞凋亡[1]。

氧化還原平衡的維持關系著細胞的生長與代謝，氧化還原狀態(tài)的實時監(jiān)測以及調(diào)控對于研究細胞的生長和高效生物轉化具有重要意義。由于復雜的氧化還原系統(tǒng)與調(diào)控網(wǎng)絡，細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的檢測以及調(diào)控面臨著巨大的挑戰(zhàn)。熒光探針信號穩(wěn)定、檢測設備簡單等優(yōu)點成為實時檢測細胞氧化還原狀態(tài)的有力工具。本文中，筆者闡述氧化還原狀態(tài)與細胞代謝的關聯(lián)，以熒光探針為主，介紹了檢測細胞氧化還原狀態(tài)的方法，并對調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)的常用方法及其在細胞工廠高效生物轉化中的應用進行了總結，展望了氧化還原狀態(tài)檢測及調(diào)控的發(fā)展趨勢。

1 細胞的氧化還原代謝物

細胞內(nèi)氧化還原反應十分復雜，參與的反應物質種類繁多，氧化還原代謝物按照其反應性質可分為以下3種：以活性氧為代表的氧化劑類、以谷胱甘肽為代表的抗氧化劑類以及以NAD(P)H為代表的輔酶類。

1.1 活性氧

圖1 活性氧的產(chǎn)生及轉化過程Fig.1 Generation and conversion of reactive oxygen species

1.2 谷胱甘肽

谷胱甘肽是一種小分子三肽，由半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)組成，其中Cys的巰基(—SH)基團是谷胱甘肽的活性基團。谷胱甘肽的生物合成過程如圖2所示，先通過由gsh1編碼的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gsh1)催化在細胞質中合成γ-谷氨酰半胱氨酸，再由gsh2編碼的谷胱甘肽合成酶(Gsh2)催化γ-谷氨酰半胱氨酸與Gly合成谷胱甘肽。雖然谷胱甘肽在細胞質中合成，但是它可以游走于線粒體、細胞核和內(nèi)質網(wǎng)等各種細胞器。谷胱甘肽在細胞內(nèi)以還原形式(GSH)和氧化形式(GSSG)兩種形式在，GSH被活性氧氧化形成GSSG，GSSG可以通過glr1編碼的谷胱甘肽還原酶，用NADPH作為還原力量供體被還原為GSH(圖2)[5]。細胞內(nèi)的GSH濃度較高(1～13 mmol/L)，通常是GSSG的30～100倍。GSH與GSSG之間的平衡，通?？梢宰鳛榧毎趸€原狀態(tài)的表征方式。谷胱甘肽的氧化還原電位(GSH potential，EGSH/GSSG)是量化表征谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)的方式，通常由GSH與GSSG的比例經(jīng)能斯特方程(EGSH/GSSG=-264+30lg[(c(GSSG)/c(GSH))2])計算得出，一定程度上反映細胞的抗氧化性能[6]。正常狀態(tài)下細胞內(nèi)的EGSH/GSSG較低，中點電位在-240 mV左右。由于GSH在不同細胞器之間的分布存在差異，因此各個細胞器之間的EGSH/GSSG也各有不同，線粒體中EGSH/GSSG的中點電位大約為-280～-250 mV，細胞質的中點電位為-290 mV，內(nèi)質網(wǎng)由于要維持氧化狀態(tài)，中點電位約為-185 mV[7]。由于谷胱甘肽重要的抗氧化作用，常用作細胞工廠抗氧化改造的靶點。

圖2 谷胱甘肽的合成及氧化還原Fig.2 Synthesis and redox of glutathione

1.3 NAD(P)+和NAD(P)H的濃度和比例

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是參與細胞內(nèi)多種反應的關鍵輔酶，主要作為一些氧化還原酶的電子載體發(fā)生作用，還能夠經(jīng)NADH激酶(NADH kinase)催化合成另一種重要的輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)[8]。NADPH參與許多氧化還原過程的調(diào)節(jié)，包括兩大抗氧化系統(tǒng)的反應等。

GSSG轉化為GSH時需要NADPH提供還原力，硫氧還蛋白也需要NADPH作為還原劑維持其氧化還原平衡[9]。但NADPH氧化酶也可以催化NADPH氧化的同時產(chǎn)生ROS[10]。因此，NADP+/NADPH是重要的氧化還原信號。

NADH和NADPH對于ROS的產(chǎn)生和清除是至關重要的。NADH作為生物氫的載體和電子供體，除了在線粒體內(nèi)膜上通過氧化磷酸化過程，轉移能量供給ATP合成以外，有可能將電子轉移至O2產(chǎn)生ROS；NADPH在維持抗氧化防御方面起主要作用，但在某些組織中也可作為自由基生成反應的輔助因子。兩種輔酶都充當“電子載體”，在細胞內(nèi)發(fā)生的氧化還原反應之間傳遞還原力。它們都可以通過接收電子，產(chǎn)生還原形式的NADH或NADPH。兩者之間的作用錯綜復雜(圖3)，都是重要的氧化還原狀態(tài)的表征信號。

圖3 NADH及NADPH的氧化還原代謝Fig.3 Redox metabolisms of NADH and NADPH

1.4 氧化還原狀態(tài)與細胞代謝

氧化還原狀態(tài)與細胞的能量代謝、生長代謝以及合成與轉化息息相關。其中，活性氧能參與細胞的免疫應答，在病原體侵入細胞時，活性氧能夠作為第二信使調(diào)控免疫相關基因的表達，并啟動某些基因的轉錄進而啟動相應的凋亡程序[3]。此外，活性氧還與細胞壁中糖蛋白交聯(lián)過程有關，有助于識別病原體，啟動相應的防御程序[11]。雖然活性氧是細胞免疫反應的信號分子，但是活性氧的過度累積會危及生物體的結構和功能。例如攻擊蛋白質的氨基酸殘基形成分子內(nèi)或分子間非極性作用，進而影響其構象和功能[12]。H2O2能夠發(fā)生跨膜作用，與相應的大分子反應，導致脂質過氧化、DNA雙鏈的斷裂和蛋白質結構的損傷等[13]。

谷胱甘肽除了作為抗氧化劑清除細胞內(nèi)的活性氧外，其氧化形式與還原形式之間的比例決定了一些蛋白質中半胱氨酸的狀態(tài)，進而影響了這些蛋白的結構和功能，GSH的大量消耗和蛋白質的谷胱甘肽化修飾是細胞凋亡的關鍵調(diào)節(jié)因子，在細胞的衰老及凋亡中作為細胞標志物[14]。

NAD+/NADH的變化影響著眾多的生理過程。例如，通過調(diào)節(jié)細胞質中NAD+/NADH比例，能調(diào)節(jié)糖酵解反應的速率。在線粒體中，作為還原力的主要供體，NADH可以經(jīng)呼吸鏈氧化為細胞提供能量。此外，NAD+/NADH還影響細胞內(nèi)的信號傳導和一些大分子生物合成等。NADP+/NADPH主要在磷酸戊糖途徑(PPP途徑)中起作用，還與一些信號傳導途徑的調(diào)節(jié)以及二氫葉酸、脂肪酸等生物大分子的合成有關[15]。

對細胞工廠的氧化還原狀態(tài)進行精細調(diào)控不僅要了解細胞的氧化還原代謝過程，而且對于氧化還原狀態(tài)的監(jiān)測方法也有著較高的要求。研究者嘗試使用電子自旋共振、拉曼光譜、免疫吸附及核磁共振等方法檢測細胞內(nèi)的活性氧[16-18]，使用酶聯(lián)免疫、液相色譜或電化學方法等測定細胞的谷胱甘肽氧化還原電位[19-21]；使用色譜法、電化學法、毛細管電泳法以及代謝物間接指示法來檢測NADP+/NADPH等[22-25]。

這些方法能夠較為準確地反映相關信號，但是都存在固有的局限性，即破壞了細胞或生物體的完整性，無法在活細胞內(nèi)實時反映氧化還原狀態(tài)。熒光探針法由于其信號穩(wěn)定、設備簡單且能夠實現(xiàn)實時原位檢測等優(yōu)點受到了青睞。

2 檢測氧化還原狀態(tài)的熒光探針

氧化還原反應代謝物中，NAD(P)H存在微弱的自發(fā)熒光，可以用于評估線粒體的狀態(tài)，但在細胞質內(nèi)濃度較低，無法相互區(qū)分且波長較短，極大可能干擾細胞的氧化還原代謝，利用熒光壽命成像技術(FLIM)可以區(qū)分結合形式的NADH和NADPH[26],但是該方式對精密儀器和復雜計算的要求較高,很難廣泛應用于實驗室研究。因此，化學熒光探針和遺傳編碼的熒光探針更適用于基礎的實驗室研究。

2.1 化學熒光探針

檢測氧化還原狀態(tài)的化學熒光探針大多具有能與信號分子結合的識別基團以及發(fā)出熒光信號的基團，發(fā)出熒光的強度反映氧化還原狀態(tài)?；瘜W熒光探針種類較多，目前用于活細胞ROS檢測的最常用探針是二氯熒光素(DCFH-DA)、羅丹明123(DHR123)和氫化乙啶(HE)[27]，用于檢測谷胱甘肽的化學熒光探針則包括5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)探針、基于吖啶橙的熒光探針等[28]，有研究通過外源添加GSH還原酶與輔酶，同時定量GSSG和GSH以實現(xiàn)EGSH/GSSG的測定，但是該方法操作較復雜，不適合基礎實驗使用[29]。檢測NAD(P)H的化學探針則大多需要先對細胞進行破碎提取，因此不適合實時反映細胞內(nèi)的狀態(tài)變化。

化學熒光探針特異性較好、信號穩(wěn)定且熒光強度較強，但不可避免地具有一定的細胞毒性，難以實現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的區(qū)域化檢測以及實時動態(tài)在線成像，遺傳編碼的熒光蛋白則是細胞氧化還原狀態(tài)實時檢測最有前景的工具。

2.2 遺傳編碼的熒光蛋白探針

遺傳編碼的熒光蛋白探針根據(jù)其作用機制可以分為基于循環(huán)置換熒光蛋白家族(cpFPs)的探針、氧化還原敏感的熒光蛋白探針(roFPs)以及熒光共振能量轉移型熒光探針(FRET)這3種。

2.2.1 基于循環(huán)置換熒光蛋白的探針

循環(huán)置換型熒光蛋白是將普通熒光蛋白的N端和C端經(jīng)過互換并用一個短肽接頭重新連接形成的熒光蛋白，這些改造使得熒光發(fā)色團的位置發(fā)生變化，容易感受外界條件的變化，從而發(fā)生相應的構象變化[30]。常見的循環(huán)置換型的熒光蛋白主要有循環(huán)置換的黃色熒光蛋白(cpYFP)和循環(huán)置換的紅色熒光蛋白(cpRFP)。利用循環(huán)置換熒光蛋白易于感知外界條件變化的特性，將其插入到氧化還原轉錄因子當中可以實現(xiàn)一系列氧化還原代謝物的檢測。目前應用較為廣泛的主要是特異性檢測H2O2的比率型探針熒光探針HyPer(H2O2)、檢測NADH水平的Frex探針和SoNar探針等。

HyPer探針是將cpYFP插入到大腸桿菌轉錄因子OxyR的調(diào)節(jié)結構域中形成的[31]，該探針表面有2個Cys可以被氧化形成二硫鍵，構象的改變使cpYFP在420 nm的激發(fā)光下熒光強度降低、500 nm激發(fā)時熒光強度升高，熒光強度的比值隨H2O2濃度的增加而增加。為了獲得更高的靈敏度和動態(tài)范圍，Bilan等[32]通過突變HyPer的OxyR-RD 得到了HyPer-2和HyPer-3。HyPer-2是HyPer的Ala406Val突變體，動態(tài)范圍擴展，但反應速率較低，有較大的缺陷；HyPer-3是HyPer的His34Tyr突變體，突變后動態(tài)檢測范圍與HyPer-2相近，但反應速率提升。在這3種探針中，HyPer-3的動態(tài)檢測范圍廣，反應速率適中，更可能獲得廣泛的應用[32]。為了擴展Hyper熒光探針的光譜范圍，用循環(huán)置換的紅色熒光蛋白cpRFP替換cpYFP產(chǎn)生了Hyper Red熒光探針，該探針的反應速度更快、靈敏度更高，但作為一個強度型熒光探針，Hyper Red易受到環(huán)境干擾，較難實現(xiàn)H2O2的穩(wěn)定測量[33]。HyPer系列探針的光譜特征和特點見表1。

Frex探針是將cpYFP插入來自枯草芽孢桿菌的轉錄因子B-Rex二聚體的亞基之間形成的，Rex上有與NADH特異性結合的區(qū)域，能夠響應NADH變化[34]。Frex探針的缺點是對pH的變化敏感，使用時需要對pH進行控制。SoNar是將cpYFP插入去除DNA結合結構域的T-Rex單個亞基中形成的，利用Rex單亞基與NAD+和NADH結合能力的強弱不同形成NAD+/NADH的比率探針[35]。SoNar的亮度和動態(tài)響應范圍是cpFP系列熒光探針中最大的(～15倍)，應用最為廣泛，但是它無法表征細胞內(nèi)總NAD的量，因為其對細胞內(nèi)生理pH的變化敏感，在使用時需要控制體系pH或設置相應對照。

除了通用的幾種探針以外，還有將cpYFP插入到T-Rex的單個亞基中形成的RexYFP探針。與Frex不同，RexYFP熒光信號的變化是由T-Rex蛋白的一個亞基內(nèi)的構象重排引起的。RexYFP是一種強度測量探針，在490 nm處具有單個激發(fā)峰，在516 nm處具有發(fā)射峰。 NADH的結合誘導指示劑熒光降低2倍。因此，該指示適用于反映細胞中NAD+/NADH的動態(tài)變化，不適合測定總NADH水平[36]。RexYFP的缺點在于熒光較弱且易受到pH的影響。Peredox探針則是將循環(huán)置換寶石藍熒光蛋白T-Sapphire插入到來自嗜熱桿菌轉錄因子NADH結合結構域T-Rex兩個亞單位之間構建而成，通過定點突變消除了探針的pH敏感性[37]。Peredox是一種強度計指示劑，在400 nm處具有單個激發(fā)峰，在510 nm處具有發(fā)射峰。為了開發(fā)具有比率讀數(shù)的探針，Peredox分別與紅色熒光蛋白(mCherry)和黃色熒光蛋白(mCitrine)融合，獲得新的比率型熒光探針[38]，Peredox的主要優(yōu)點是它不受pH影響，能夠抵抗生理范圍內(nèi)的pH變化，缺點是容易氧化飽和，因此只適合于細胞質和線粒體的檢測。

綜上所述，基于循環(huán)置換蛋白的探針性質和特點見表1。

表1 基于循環(huán)置換蛋白的探針性質和特點

2.2.2 氧化還原敏感的熒光蛋白家族

氧化還原敏感的熒光蛋白(roFP)是在通用的熒光蛋白基礎上經(jīng)突變引入2個半胱氨酸殘基形成的。當細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)發(fā)生變化時，2個Cys殘基經(jīng)氧化形成二硫鍵，使得蛋白質的質子化狀態(tài)發(fā)生變化，影響發(fā)光基團。目前應用最廣泛的氧化還原敏感型綠色熒光蛋白roGFP是將增強型綠色熒光蛋白(eGFP)β鏈上的S147和Q204突變?yōu)镃ys后形成的[39]。roGFP經(jīng)氧化后，2個Cys殘基形成二硫鍵，構象重排使得激發(fā)波長發(fā)生變化，在405 nm處激發(fā)的熒光強度下降，而488 nm處激發(fā)的熒光強度增強，二者比值的改變能夠反映氧化還原狀態(tài)的變化[39]。roGFP的檢測反應時間較長、還原性較強、易于過氧化，因此檢測范圍有限，更適用于氧化強度較低的亞細胞結構，如細胞質、線粒體等。研究者通過C48S和S65T兩處點突變，獲得了更高強度且具有更高動態(tài)范圍的roGFP2，但仍未解決roGFP2檢測速度慢和特異性較差的問題[39-40]。

將roGFP2與氧化還原相關酶的融合這一策略為roGFP2選擇性和靈敏度的提升以及廣泛應用提供了新的視野。將roGFP2酵母過氧化物酶Orp1實現(xiàn)了細胞內(nèi)H2O2的特異性檢測[41]，為了提升靈敏度與反應速度，Morgan等[42]將roGFP2分別與釀酒酵母的所有過氧化物酶融合，最終篩選獲得了較高靈敏度的過氧化物酶Tsa2，再經(jīng)過單個氨基酸突變提高了反應速度。除了融合過氧化物酶檢測H2O2，融合谷胱甘肽氧化還原酶Grx1特異性檢測谷胱甘肽也是一個很好的研究方向，其反應原理是通過GSSG與Grx1反應，再經(jīng)過分子內(nèi)重排產(chǎn)生二硫鍵，改變蛋白的構象，進而影響激發(fā)波長[43]。Grx1與roGFP2的融合提升了檢測的靈敏度和反應速度，但是沒有影響roGFP2的光譜特征，而且Grx1-roGFP2對谷胱甘肽氧化還原電位具有高度特異性，不與硫氧還蛋白系統(tǒng)發(fā)生反應，是優(yōu)良的EGSH/GSSG檢測器。

除了roGFP以外，還有一系列基于相同原理開發(fā)的熒光蛋白探針。例如，roCherry是將紅色熒光蛋白mCherry的150Ala和203Lys突變?yōu)镃ys后形成的，再與Grx1融合可以實現(xiàn)谷胱甘肽的特異性檢測；Grx1-rocherry的激發(fā)和發(fā)射波長分別為589和610 nm，中點氧化還原電位為-310 mV。該熒光探針的亮度較高且具有pH穩(wěn)定性[44]，是檢測活細胞EGSH/GSSG很有潛力的工具。

氧化還原敏感的黃色熒光蛋白(rxYFP)中相鄰的β鏈上有2個Cys殘基，可以與GSSG發(fā)生反應，再經(jīng)過分子內(nèi)重排形成二硫鍵導致熒光強度降低。rxYFP是一個強度指示性的熒光探針，最大激發(fā)波長在512 nm處，最大發(fā)射波長在523 nm處[45]。rxYFP的中點氧化還原電位為-261 mV。因為生理條件下，細胞內(nèi)EGSH/GSSG為-270～-120 mV，所以rxYFP能夠檢測細胞內(nèi)大多數(shù)的EGSH/GSSG變化[45]。rxYFP已成功用于監(jiān)測酵母和哺乳動物細胞中不同亞細胞區(qū)室中谷胱甘肽的氧化還原狀態(tài)，如細胞質、細胞核、線粒體基質和線粒體膜間隙[46-48]。rxYFP的缺點是對細胞內(nèi)生理pH變化和Cl-具有敏感性。

綜上所述，氧化還原敏感的熒光蛋白的性質和特點見表2。

表2 基于氧化還原敏感的熒光探針性質和特點

2.2.3 基于FRET的熒光對

熒光共振能量轉移(FRET)是2個相鄰生色團之間的非輻射能量傳遞過程。當供體生色團和受體生色團之間的距離發(fā)生改變時，熒光的情況也會發(fā)生相應的變化。檢測氧化還原的熒光對通常是由一段含有2個Cys殘基的多肽鏈連接形成的，在氧化條件下，2個Cys形成分子內(nèi)二硫鍵，F(xiàn)RET供體和受體之間的距離發(fā)生改變，從而使得熒光發(fā)生變化。最經(jīng)典的FRET熒光對是ECFP和EYFP，通過改變熒光對之間的接頭，開發(fā)出了一系列靈敏度各不相同的探針。最初，Lam等[49]利用釀酒酵母轉錄因子能夠感知氧化還原狀態(tài)的特點，選擇其感知區(qū)域作為多肽接頭，開發(fā)了感知谷胱甘肽氧化還原電位的熒光探針。為了提升反應速度，將半胱氨酸殘基隨機插入EAAAK重復序列的多肽中，篩選出一種名為RL5的多肽作接頭，可以迅速響應氧化還原狀態(tài)變化[50]。而為了擴展熒光對的動態(tài)范圍，人們開發(fā)了clover和mRuby2，它們是迄今為止最亮的綠色和紅色熒光蛋白對，用帶有Cys的多肽將它們連接，并通過分子模擬選擇最合適的反應距離，開發(fā)的clover-mRuby2探針具有響應EGSH/GSSG的能力[51]?；贔RET還開發(fā)了一系列檢測輔酶含量和比例的探針，如NADP+/NADPH探針Apollo-NADP[52]、NADP+熒光探針NADPsor[53]及NAD+熒光探針ligA-cpVenus[54]等。但是這些探針由于動態(tài)范圍較小、反應條件苛刻等原因，目前應用范圍較窄。

雖然基于FRET的熒光探針發(fā)展迅速，但是該類熒光探針的穩(wěn)定性和敏感性都不夠高，而對檢測條件要求較高，目前在氧化還原狀態(tài)的測定上尚未獲得普遍應用。

2.2.4 基于轉錄因子的熒光探針

基于轉錄因子的熒光探針是利用轉錄因子能與相應代謝物結合的特性[55]，構建基因線路，使得轉錄因子與代謝物結合后，啟動下游基因轉錄實現(xiàn)相應的檢測。例如，Zhang等[56]和Liu等[57]分別利用釀酒酵母轉錄因子Yap1和大腸桿菌轉錄因子Rex設計基因線路實現(xiàn)NAD+/NADH的檢測。這一類熒光探針無需對熒光蛋白結構進行改造，但是在不同的細胞中需要選擇不同的轉錄因子重新進行線路設計，不具有普適性。

3 氧化還原狀態(tài)調(diào)控在細胞工廠中的應用

氧化還原的平衡能夠使得細胞處于良好的生理狀態(tài)，對細胞工廠穩(wěn)定生長以及生物燃料、生物醫(yī)藥、化學品的高效合成具有重要意義。因此，對氧化還原狀態(tài)的調(diào)控是實現(xiàn)細胞工廠高效生產(chǎn)的有效途徑。早期由于實驗條件的限制，大多通過增加溶氧或改善發(fā)酵條件的方式來實現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的調(diào)控。隨著生物技術的發(fā)展，氧化還原狀態(tài)的檢測方法更加多元化，基因編碼的熒光探針也在研究氧化還原的機制和原理上發(fā)揮著重要作用。而氧化還原代謝機制的深入發(fā)展使得對細胞氧化還原狀態(tài)實現(xiàn)更精細有效的調(diào)控成為可能。目前常用的調(diào)控細胞工廠氧化還原狀態(tài)的策略主要包括對細胞抗氧化系統(tǒng)、氧化還原相關轉錄因子、氧化還原關鍵的輔酶等的調(diào)控。

3.1 抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控

改造細胞的抗氧化系統(tǒng)是調(diào)節(jié)細胞工廠氧化還原狀態(tài)最直接也是最有效的方式。Xu等[58]通過在釀酒酵母中導入植物及極端微生物來源的抗氧化酶構造了一種人工抗氧化防御系統(tǒng)，實現(xiàn)了釀酒酵母的耐熱性以及乙醇產(chǎn)量的提升，乙醇產(chǎn)量與對照相比提升了66%，還通過DCFA-HA探針檢測了細胞內(nèi)的ROS，證明了氧化防御系統(tǒng)在維持線粒體和細胞膜完整性上具有明顯作用。另外，過表達谷胱甘肽合成途徑的關鍵基因gsh1、cys3和glr1也可以調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)，增加GSH的含量和比例，進而減輕木質纖維素水解副產(chǎn)物在發(fā)酵中的抑制作用，使得菌株的魯棒性和發(fā)酵性能提升，而谷胱甘肽的含量以及EGSH/GSSG的測定則是由DTNB熒光探針來完成的[59]。Xu等[60]在產(chǎn)油酵母中的研究證明，谷胱甘肽還原酶以及相關脫氫酶的過量表達能夠改善酵母細胞的形態(tài)，促進脂質的高效合成，細胞含油量達到81.4%，產(chǎn)量接近工業(yè)生產(chǎn)需求。

此外，引入外源的谷胱甘肽合成和還原路徑，也是調(diào)控細胞氧化還原狀態(tài)、實現(xiàn)細胞工廠抗脅迫性能和生產(chǎn)性能的有效方法[61-62]。除了調(diào)節(jié)細胞酶促抗氧化系統(tǒng)，也可以引入外源抗氧化劑合成途徑實現(xiàn)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)以及細胞工廠的高效生物轉化。例如，番茄紅素作為抗氧化劑被廣泛用于食品藥品行業(yè)，在酵母中引入異源番茄紅素合成途徑不僅可以通過積累番茄紅素來增加細胞活力，還可以提高厭氧發(fā)酵過程中乙酸耐受性和乙醇生產(chǎn)水平[63]。這一系列的研究結果中，抗氧化系統(tǒng)的改造對于提升細胞的抗脅迫性能和產(chǎn)能有著重要的意義。

3.2 輔酶調(diào)控

NAD(P)+和NAD(P)H不僅與氧化還原代謝有關，還耦聯(lián)細胞的碳代謝和能量代謝，參與的代謝網(wǎng)絡復雜。基因編碼的熒光探針能夠實現(xiàn)細胞內(nèi)輔酶水平的實時監(jiān)測，分析輔酶的代謝機制和影響輔酶的因素，進而對參與氧化還原的輔酶進行精準的調(diào)控[64]。根據(jù)輔酶的代謝機制，調(diào)控輔酶的策略主要有以下幾種。

1)敲除輔酶競爭途徑是一種增加輔酶可用性以驅動目標代謝物形成的有效方法。在糖酵解中，NADH的消耗與多種產(chǎn)物的生物合成有關，包括乙醇、乳酸鹽和某些氨基酸等。Saini等[65]研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除乳酸脫氫酶的基因ldh或激活丙氨酸脫氫酶的基因ald，可以讓更多的NADH驅動大腸桿菌中丙二醇、丁醇和其他醇的產(chǎn)生。而敲除編碼乙酸激酶和乳酸脫氫酶的基因，并過表達編碼丁酸激酶的基因可以更多地生產(chǎn)丁酸鹽[66]。

2)調(diào)節(jié)輔酶合成或再生途徑的關鍵酶也可以調(diào)節(jié)輔酶的狀態(tài)，影響細胞狀態(tài)和產(chǎn)量。例如，將NAD再生途徑引入工程化生產(chǎn)異丁醇的大腸桿菌中，由于NADH水平的增加，提升了糠醛耐受性，從而提高了其發(fā)酵生產(chǎn)能力[67]。Wu等[68]研究表達了多種不同來源的NADH脫氫酶，提升了NADH的再生能力，實現(xiàn)了賴氨酸在谷氨酸棒桿菌中的高效生產(chǎn)。而在植物甾醇發(fā)酵系統(tǒng)中，通過添加NAD的前體以及表達來自短乳桿菌的NADH氧化酶，改善了NAD+和NADH在細胞內(nèi)的比例，使得工程菌株甾醇的轉化率最終提高了147%[69]。通過突變磷酸戊糖途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡糖酸脫氫酶，降低它們對細胞內(nèi)代謝物抑制劑的敏感性，可以富集細胞內(nèi)的NADPH，得到的谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸產(chǎn)率提高了53.2%[70]。

3)改造天然輔酶的特異性也可以調(diào)節(jié)氧化還原平衡。用來自枯草芽孢桿菌的NADP+依賴性的甘油醛-3-磷酸脫氫酶取代谷氨酸棒桿菌內(nèi)源的NAD+依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶，提高了細胞內(nèi)NADPH的水平，使得NADPH依賴性化合物的合成水平獲得了提高[71]。利用輔酶結合的特異性對輔酶進行修飾也可以調(diào)節(jié)細胞的氧化還原平衡。通過對谷氨酸棒桿菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶的NADH結合區(qū)域的保守序列進行突變[71]，或者引入非天然的異檸檬酸脫氫酶基因idh都實現(xiàn)了L-賴氨酸產(chǎn)量的提高[72]。在能夠生產(chǎn)L-乳酸的釀酒酵母工程菌株中敲除細胞質的NADH脫氫酶，提高了細胞內(nèi)NADH的水平，工程菌株在酸性條件下L-乳酸產(chǎn)量實現(xiàn)了32.6%的提升[73]。

綜上可知，基因編碼的熒光探針檢測輔酶水平的變化與代謝工程方法調(diào)控輔酶結合在實現(xiàn)細胞工廠的高效生物轉化過程中有著重要意義。

3.3 轉錄因子調(diào)控

細胞內(nèi)氧化還原相關的轉錄因子除了用于開發(fā)相應的生物傳感器以外，還可以作為智能精細調(diào)控細胞工廠生物轉化的有力工具。酵母中氧化還原相關轉錄因子Yap1的過表達能夠促進氧化防御相關基因的轉錄，提高細胞的抗氧化能力，減少氧化應激引起的蛋白質錯誤折疊，從而提高細胞分泌蛋白的能力[74]。而氧化應激調(diào)節(jié)轉錄因子Ybp1的過表達能夠消除ROS，增強細胞活力最終在酵母細胞工廠中實現(xiàn)人參二醇的高效生產(chǎn)[73]。Zhang等[75]利用轉錄因子Rex上調(diào)idh的表達，idh可以調(diào)節(jié)NADH/NAD+的比例，最終實現(xiàn)丙酮和丁醇的高效生產(chǎn)。大腸桿菌的轉錄調(diào)節(jié)因子Hdfr可以顯著提高NADPH的利用率，加強NADPH依賴性谷氨酸合成[76]。這些研究表明，氧化還原相關轉錄調(diào)節(jié)因子是一種調(diào)控氧化還原狀態(tài)的有效方法。

4 結論與展望

氧化還原狀態(tài)的調(diào)控在開發(fā)生產(chǎn)生物燃料、生物醫(yī)藥以及生物基化學品的細胞工廠中發(fā)揮了重要的作用，優(yōu)良的檢測方法是進行精確調(diào)控的基礎?；蚓幋a的氧化還原探針飛速發(fā)展，其靈敏度與檢測限都在不斷提升，更是開發(fā)出了能夠定位于不同細胞器的氧化還原熒光探針。但是其檢測原理較為單一，大多基于半胱氨酸氧化形成二硫鍵，改變熒光蛋白的構象，而且由于基因編碼的熒光探針需要對宿主細胞進行基因操作，不可避免對細胞工廠的代謝產(chǎn)生影響。

隨著新一代測序和基因操作的發(fā)展，細胞工廠的代謝機制將會更加清晰。檢測氧化還原反應的熒光探針不僅需要更快的反應速度與靈敏度，還需要更加廣泛的監(jiān)測范圍，能夠監(jiān)測更多的氧化還原相關的代謝物和反應，更需要擴展現(xiàn)有熒光蛋白的光譜特征，不能僅局限于常見的紅色和綠色熒光，紅外領域也可以作為開發(fā)的目標。同時，熒光探針方法還可以與電子自旋共振、電化學等方法相結合，綜合表征細胞的氧化還原狀態(tài)。氧化還原狀態(tài)作為重要的生理指標，其監(jiān)測與調(diào)控都需要更多的研究探索，進而在工業(yè)微生物中進行精準有效的調(diào)節(jié)，減少冗余的基因線路帶來的負擔，實現(xiàn)細胞工廠中目標產(chǎn)物的高效生產(chǎn)。