大豆萌發(fā)期脂肪氧化酶與脲酶活性變化及鈍化方法效果評價

邢竺靜，李笑梅，趙廉誠，石彥國，王如夢，閆怡宏，張娜

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150076）

眾所周知，大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)（40%～50%），油脂（20%左右）以及多種對人體有益的活性物質(zhì)[1-2]。但是，也含有一些抗營養(yǎng)因子（antinutritional factors，ANFs）：脂肪氧化酶（lipoxygenase，Lox）、脲酶、胰蛋白酶抑制劑、植酸等[3-5]。這些抗營養(yǎng)因子的存在不僅使大豆制品的品質(zhì)下降，而且會影響其制品的風味和機體對營養(yǎng)素吸收和利用[6]。而且Lox 氧化能力較強，可氧化大豆中的多種維生素，從而降低維生素有效性[7-10]。此外，Lox 可以催化大豆及其制品中的不飽和脂肪酸的氧化，產(chǎn)生醛、醇等物質(zhì)，并產(chǎn)生豆腥味[11]；脲酶遇水可迅速將含氮物質(zhì)分解成氨，大量氨的存在會引起機體氨代謝障礙，使人中毒[12-13]。大豆及其制品中兩種酶的活性高低影響到產(chǎn)品品質(zhì)，因此關(guān)于抗營養(yǎng)因子的鈍化便一直受到關(guān)注。

目前，抗營養(yǎng)因子的鈍化主要包括物理方法、化學方法、生物方法[13-15]。物理方法有微波輻射、烘烤、蒸煮、漂燙等，其應用最為廣泛，成本較低，且處理后的原料可以加工多種類型的產(chǎn)品；化學方法有pH 值處理、尿素處理、乙醇處理、亞硫酸鈉處理、偏重亞硫酸鈉處理等通過改變分子結(jié)構(gòu)[13]的方式，但容易造成化學殘留，產(chǎn)生污染環(huán)境；生物方法常用的是發(fā)酵、酶制劑處理[16]，雖然安全但成本較高、而且后續(xù)只能用于加工發(fā)酵類型的制品；還有利用種子萌發(fā)的方法使抗營養(yǎng)因子含量下降，其優(yōu)點是自然安全，可用于制備豆?jié){、發(fā)芽飲料等萌動食品。因此，物理與萌發(fā)方法優(yōu)勢突出，近幾年在大豆發(fā)芽后的抗營養(yǎng)因子的鈍化作用有較多研究，但是在萌發(fā)即未發(fā)芽階段的研究仍鮮有報道。

本試驗以兩個品種大豆為原料，探討了大豆在萌發(fā)期Lox、脲酶活性變化，再進一步以萌發(fā)豆為研究對象，在比較微波輻射、烘烤、漂燙鈍化方法效果基礎(chǔ)上，選擇適宜的方法并進行參數(shù)確定，并對Lox 酶促反應產(chǎn)物醛醇類物質(zhì)進行定性定量分析，評價鈍化效果。研究旨在達到最大限度降低萌發(fā)大豆及豆?jié){因抗營養(yǎng)因子及Lox 導致的豆腥味問題，為萌發(fā)大豆產(chǎn)品的發(fā)展提供技術(shù)支持；為大豆綜合加工利用，加強大豆產(chǎn)品的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑農(nóng)71：黑龍江省農(nóng)科院大豆所；黑科56：黑龍江省農(nóng)科院黑河分院。

尿素：天津碩?；び邢薰?；磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀：無錫市晶科化工有限公司；硼砂、硼酸：濟寧輝鵬化工有限公司；亞油酸：江西貝爾高科新材料有限公司；亞油酸：上海阿拉丁生化科技有限公司，均為分析純；2-甲基-3-庚酮：美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha-1506 紫外可見分光光度：上海譜元儀器有限公司；TG16-WS 臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9203AD 電熱恒溫干燥箱：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；P70F23P-G5 微波爐：廣東格蘭仕集團有限公司；Agilent5973 氣質(zhì)聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆萌發(fā)

將兩個品種大豆以豆水比1 ∶5（g/mL）進行浸泡萌發(fā)，在 25 ℃下，分別萌發(fā) 4、8、12、16、20 h（當萌發(fā)時間超過20 h 時，大豆開始發(fā)芽，為發(fā)芽大豆），然后將大豆瀝水，放入45 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥，制成粉狀樣品，分別測定脲酶和Lox 活性，評價抗營養(yǎng)因子的變化，選擇活性最低的萌發(fā)條件得到的萌發(fā)大豆作為鈍化處理的樣品。

1.3.2 脲酶活性測定

參照GB/T 8622-2006《飼料用大豆制品中尿素酶活性的測定》[17]執(zhí)行。

結(jié)果計算：脲酶活性X，單位為U/g，按公式（1）計算。

式中：X 表示試樣的脲酶活性，U/g；c 表示氫氧化鈉標準滴定溶液濃度，mol/L；V0表示空白消耗氫氧化鈉標準滴定溶液體積，mL；V 表示試樣消耗氫氧化鈉標準滴定溶液體積，mL；14 表示氮的摩爾質(zhì)量，M（N2）=14 g/mol；30 表示反應時間，min；M 表示試樣質(zhì)量，g。

1.3.3 Lox 活性測定

采用亞油酸-吐溫60 紫外分光光度計方法[18]進行測定：取大豆粉用0.015 mol/L，pH 8.2 的Tris-HCl 緩沖液離心（4 000 r/min）5 min，取上清液 0.2 mL 和亞油酸吐溫60 制成的底物2.8 mL 于石英比色皿內(nèi)，混合均勻，在234 nm 處記錄OD 值變化，每15 秒記錄一個數(shù)據(jù)。計算公式見公式（2）。

式中：Λ 表示酶的活性單位；OD 表示30 s 及15 s時的OD 值；0.01 表示一個常數(shù)，即每分鐘增加0.01 吸光度所需的活性作為大豆Lox 的一個活性單位。

1.4 鈍化抗營養(yǎng)因子方法的篩選

分別選擇了烘烤、微波和沸水漂燙3 種方法處理萌發(fā)大豆，測定脲酶和Lox 活性，選擇能使脲酶和Lox活性降低幅度大的處理方法，同時以未處理且在適宜浸泡條件下萌發(fā)大豆為對照。

1.4.1 烘烤處理

將50 g 萌發(fā)大豆散開平鋪放入150 ℃烘箱內(nèi)，烘烤8 min，45 ℃烘干，測定脲酶和Lox 活性。

1.4.2 微波處理

將50 g 萌發(fā)大豆散開平鋪于微波玻璃盤中，中火（385 W）微波處理30 s，45 ℃烘干，測定脲酶和Lox活性。

1.4.3 漂燙處理

將50 g 萌發(fā)大豆放入沸水中漂燙30 s，45 ℃烘干，測定脲酶和Lox 活性。

1.5 鈍化抗營養(yǎng)因子條件確定

將50 g 萌發(fā)大豆進行沸水漂燙，考察不同漂燙時間 10、20、30、40、50、60、70 s 對脲酶和 Lox 活性的影響，確定適宜漂燙時間。

1.6 豆腥味物質(zhì)含量測定

采用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography－mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS） 結(jié)合的方法[19-20]略有改動，進行測定。

HS-SPME 條件：在20 mL 萃取瓶中放入轉(zhuǎn)子，加入5 g 樣品迅速旋緊蓋子，用微量進樣器穿透瓶塞加入 10 μL 的內(nèi)標物（2-甲基-3-庚酮 100 mg/kg），使用DVB/CAR/PDMS-50/30 μm 萃取頭，萃取溫度 40 ℃，頂空吸附30 min。

GC-MS 條件：選用DB-WAX 色譜柱；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：40 ℃保持 8 min，然后以 4 ℃/min 升溫至 150 ℃，再以 20 ℃/min 升溫至 250 ℃，保持 5 min，不分流進樣；載氣：99.999 %高純度氮氣；載氣流速：1 mL/min。離子源：EI 源；電子能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；掃描范圍（m/z）：30～500；采集方式：Scan。

1.7 Lox活性與兩種萌發(fā)大豆豆腥味物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

采集試驗中Lox 活性與兩種萌發(fā)大豆豆腥味物質(zhì)含量的數(shù)據(jù)，利用SPSS 23.0 進行相關(guān)性分析，得到Lox活性與兩種萌發(fā)大豆豆腥味物質(zhì)含量的相關(guān)系數(shù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗取3 次平行測得平均值，均以mean±sd 表示。采用Origin、SPSS Statistics 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 萌發(fā)時間對脲酶的影響

萌發(fā)時間對脲酶活性的影響見圖1。

圖1 萌發(fā)時間對脲酶活性的影響Fig.1 Effect of germination time on urease activity

由圖1 可知，兩種品種大豆在萌發(fā)時間＜4 h 時，脲酶活性顯著下降（P＜0.05），當萌發(fā)時間超過 4 h 時，脲酶活性下降幅度平緩且無顯著差異（P＞0.05）；黑科56在萌發(fā) 16 h～20 h 時，脲酶的活性下降顯著（P＜0.05）。

這是由于大豆在萌發(fā)過程中，大豆中抑制脲酶活性的因子在在厭氧的環(huán)境下未與空氣接觸，未氧化[21]造成組織結(jié)構(gòu)破壞[22]。當萌發(fā)時間超過4 h 時，大豆中脲酶活性抑制因子已經(jīng)全部與脲酶接觸，因此，脲酶的活性在4 h 后趨于穩(wěn)定。

2.2 萌發(fā)時間對Lox的影響

萌發(fā)時間對Lox 活性的影響見圖2。由圖2 可知，兩個品種大豆在萌發(fā)0～20 h 時，Lox 的活性顯著呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05）。官品質(zhì)。Skrzypczak 等[23]發(fā)現(xiàn)發(fā)芽24 h 后大豆中Lox的活力明顯減弱；Paucar[24]、Bordingnon[25]也得到了相似的結(jié)果。綜合兩種品種的大豆在萌發(fā)過程中脲酶與Lox 活性的變化，選取萌發(fā)時間20 h 為兩種大豆的萌發(fā)時間。

圖2 萌發(fā)時間對Lox 活性的影響Fig.2 Effect of germination time on lipoxygenase activity

2.3 鈍化抗營養(yǎng)因子方法及參數(shù)的確定

2.3.1 鈍化抗營養(yǎng)因子方法的篩選結(jié)果

3 種不同鈍化方法對兩種萌發(fā)大豆脲酶活性影響見圖3。

圖3 不同鈍化方法對兩種萌發(fā)大豆脲酶活性影響Fig.3 Effects of different passivation methods on urease activity of two germinated soybeans

由圖3 可知，沸水漂燙鈍化的方式較未處理的樣品相比，脲酶活性出現(xiàn)極顯著下降的情況（P＜0.01），烘烤與微波鈍化的方式處理的兩種萌發(fā)大豆脲酶活性顯著低于較未處理的樣品（P＜0.05）。經(jīng)過沸水漂燙后，黑科56 與黑農(nóng)71 的脲酶活性分別降到1.94 U/g 和1.78 U/g。

因此，采用沸水漂燙對兩個品種的萌發(fā)大豆進行鈍化處理效果最佳。

3 種不同鈍化方法對兩種萌發(fā)大豆Lox 活性影響見圖4。

圖4 不同鈍化方法對兩種萌發(fā)大豆Lox 活性影響Fig.4 Effects of different passivation methods on lipoxygenase activity of two germinated soybeans

由圖4 可知，用相同方法處理兩個品種時，對Lox活性的影響趨勢相似，與未處理的樣品相比，沸水漂燙、烘烤、微波處理后的樣品，Lox 活性均顯著下降（P＜0.05），經(jīng)沸水漂燙處理后的Lox 活性較其他兩種處理方法及未處理的樣品顯著下降（P＜0.05），且兩個品種萌發(fā)大豆Lox 活性分別降到了13.40 U 和16.53 U。

綜合可知，用相同方法處理兩種品種時，對脲酶和Lox 活性的影響略有不同，對Lox 活性的鈍化效果顯著好于對脲酶活性的鈍化效果（P＜0.05）。這是由于兩種酶的蛋白結(jié)構(gòu)不同，所以遇熱變形失活程度不同。不同方法處理的兩種大豆對兩種酶的鈍化效果均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），且均為沸水漂燙的鈍化效果最佳。3 種鈍化方法的機理不同，烘烤是利用高溫空氣為介質(zhì)作用于大豆，微波是通過微波爐內(nèi)產(chǎn)生的電磁波作用于大豆，漂燙是利用熱水為介質(zhì)作用于大豆。在3 種鈍化方法中，沸水漂燙的鈍化效果最明顯，微波鈍化效果其次，烘烤鈍化效果最差。因此適宜的鈍化方式為沸水漂燙處理。

2.3.2 沸水漂燙時間對抗營養(yǎng)因子的影響

沸水漂燙不同時間對兩種酶的影響結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 沸水漂燙不同時間對黑科56 兩種酶活性影響Fig.5 Effect of boiling water blanching on the activities of two enzymes in Hei Ke56

圖6 漂燙不同時間對黑農(nóng)71 兩種酶活性影響Fig.6 Effect of boiling water blanching on the activities of two enzymes in Hei Nong71

由圖5、圖6 可知，隨著沸水漂燙時間的增加，兩個品種萌發(fā)大豆的Lox 與脲酶活性呈下降趨勢。當沸水漂燙時間在0～40 s 時，Lox 與脲酶活性均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05），在 40 s～70 s 中，兩種酶的活性無顯著變化（P＞0.05）。

這是由于Lox 的穩(wěn)定溫度在20 ℃～30 ℃，在沸水狀態(tài)下，漂燙時間的增加可以使酶蛋白逐漸變性失活[26]，杜鵑[27]也證實，常壓100 ℃熱處理，可使大豆中的酶類蛋白失活。大量文獻表明，90 ℃以上濕熱漂燙可使Lox完全失活，可以在大豆萌發(fā)過程中便無Lox 產(chǎn)生豆腥味，脲酶也無法產(chǎn)生尿素使人體中毒[28]。

綜上所述，黑科56 與黑農(nóng)71 的最適沸水漂燙時間為40 s。

2.4 Lox活性與豆腥味物質(zhì)含量的相關(guān)性分析

兩種萌發(fā)大豆Lox 活性與豆腥味物質(zhì)含量變化結(jié)果見圖7、圖8。

圖7 黑科56 Lox 活性與豆腥味物質(zhì)含量變化Fig.7 Changes of lipoxygenase activity and soybean flavor content in Hei Ke 56

圖8 黑農(nóng)71 Lox 活性與豆腥味物質(zhì)含量變化Fig.8 Changes of lipoxygenase activity and soybean flavor content in Hei Nong71

Kumar.V[29]的研究結(jié)果表明，己醛、己醇和1-辛烯-3-醇是豆腥味的主要成分。由圖7、8 可知，兩個品種大豆中的豆腥味物質(zhì)含量變化存在規(guī)律性變化，隨著萌發(fā)時間的增加，己醛、己醇和1-辛烯-3-醇的含量下降，且經(jīng)過沸水漂燙后的萌發(fā)大豆3 種物質(zhì)含量均達到最低。

Lox 活性與兩種萌發(fā)大豆豆腥味的相關(guān)性結(jié)果見表1。

表1 Lox 活性與兩種萌發(fā)大豆豆腥味的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between lipoxygenase activity and flavor of two germinated soybeans

由表1 可知，在兩種萌發(fā)大豆鈍化試驗中對Lox活性與豆腥味物質(zhì)含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，己醛、己醇、1-辛烯-3-醇與Lox 活性的相關(guān)系數(shù)為分別為0.935、0.892、0.844，均呈極顯著正相關(guān)。因此，一定程度上可以說明在兩種萌發(fā)大豆的鈍化試驗中，豆腥味物質(zhì)含量的變化與Lox 活性存在直接關(guān)聯(lián)，也印證了Lox 活性的下降會有效地降低大豆豆腥味對大豆制品品質(zhì)的影響。

3 結(jié)論

本試驗為抑制大豆在萌發(fā)初期抗營養(yǎng)因子對大豆品質(zhì)的影響，以黑科56、黑農(nóng)71 兩個品種大豆為原料，以脲酶活性、Lox 活性為指標，得出了適宜的萌發(fā)條件為25 ℃，20 h，此時與未萌發(fā)大豆相比，Lox 活性分別降低了38.27%、46.31%，脲酶活性分別降低了25.04%、16.46%。沸水漂燙、烘烤、微波3 種鈍化方式中篩沸水漂燙為最適鈍化方式，其工藝參數(shù)為沸水漂燙40 s，此時Lox 活性分別降低了89.19%、88.99%，脲酶活性分別降低了96.19%、97.30%。經(jīng)相關(guān)性分析得出：兩種萌發(fā)大豆的豆腥味物質(zhì)含量與Lox 活性的變化呈極顯著正相關(guān)（己醛、己醇、1-辛烯-3-醇與Lox活性的相關(guān)系數(shù)為分別為0.935、0.892、0.844）。此研究得到的試驗數(shù)據(jù)可以為減少大豆制品中抗營養(yǎng)因子及豆腥味提供理論基礎(chǔ)，為大豆萌發(fā)產(chǎn)品的發(fā)展提供了技術(shù)支持。