環(huán)磷酰胺對MFC荷瘤小鼠影響的1H NMR代謝組學(xué)初步研究*

陶柱萍，厲 穎，常 旭，歐紅利，江 倫，王雪雪，李燦委，范孟然，劉衛(wèi)紅，白 麗，高鵬飛1,2,

(1 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000; 2 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000；3 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000；4 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理671000；5 大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；6 大理大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000)

惡性腫瘤的死亡率高，預(yù)后差，嚴(yán)重威脅人類的健康，為患者、家屬和社會帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，其中胃癌是世界上最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，在全球癌癥死亡率中居第三位[1-2]。

環(huán)磷酰胺(CTX)為烷化劑類抗腫瘤藥，也是細(xì)胞毒性免疫抑制藥[3]。它可以抑制細(xì)胞的DNA合成，干擾細(xì)胞的增殖，抑制抗體形成等[4]。CTX進(jìn)入體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量磷酰胺酶或磷酸酶水解，轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨饔玫牧柞０返娑鹱饔肹5]。

近年來，代謝組學(xué)作為一種新興的“組學(xué)”技術(shù)，已成功地應(yīng)用于各種系統(tǒng)生物學(xué)領(lǐng)域，分析疾病治療過程中生物體系內(nèi)發(fā)生的代謝物和代謝通路的改變，從整體角度研究生物體的功能水平[6]。由于核磁共振(NMR)技術(shù)具有高通量、無創(chuàng)性和良好的重現(xiàn)性及前處理簡單等優(yōu)點[7]，以1H NMR為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于腫瘤差異代謝物的鑒定、監(jiān)測以及抗腫瘤藥物的研究[8]。目前，CTX廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤治療，關(guān)于CTX抗腫瘤作用的代謝組學(xué)研究報道較少，本研究主要從代謝組學(xué)的角度探究CTX的抗腫瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗藥物與試劑

環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 細(xì)胞株

MFC小鼠胃癌細(xì)胞，取自615小鼠胃癌組織，屬于上皮腫瘤細(xì)胞系，呈貼壁生長，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.3 動 物

6～8周齡SPF級Balb/c小鼠，每只20 g左右，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，SYXK(湘)2016-0002。

1.1.4 儀 器

核磁共振儀(Bruker 800 MHz)，瑞士Bruker公司； CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AIC)，SANYO 公司；組織破碎儀(MICCRA D-1)，邁卡萊客(廣州)工業(yè)技術(shù)有限公司；低溫高速離心機(jī)(SIGMA 3-15)，西格瑪實驗室離心機(jī)公司；真空離心濃縮儀(LABCONCO CentriVap)，北京照生行儀器設(shè)備有限公司；冷凍干燥機(jī)(GOLD-SIM)，金西盟(北京)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 MFC細(xì)胞體外培養(yǎng)

取MFC細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇，用10% FCS-RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用無菌PBS調(diào)整將MFC細(xì)胞懸液調(diào)為1×107mL-1的濃度后備用。

1.2.2 分組及給藥

將小鼠隨機(jī)分為模型組和CTX給藥組，每組6只。75%酒精消毒小鼠右側(cè)腋下，棉球擦干后進(jìn)行皮下注射0.2 mL MFC細(xì)胞懸液。于接種腫瘤后次日開始給藥，模型組灌胃給予生理鹽水(20 mL/kg)，1次/日；CTX給藥組腹腔注射給予CTX(45 mg/kg，10 mL/kg)，1次/2日，共給藥10天。

1.2.3 樣品的收集與處理

小鼠末次給藥24 h后，頸椎脫臼處死，收集小鼠肝臟組織，取肝臟0.1 g加入冰甲醇/H2O(2:1)溶液勻漿，離心后取上清，并用真空離心濃縮儀濃縮，隨后置于冷凍干燥儀中冷凍干燥得凍干粉。加入K2HPO4/NaH2PO4緩沖液，渦旋混勻，低溫離心取上清于-80 ℃保存用于NMR檢測。

1.2.41H NMR 圖譜采集與分析

小鼠肝臟圖譜選用BRUKER 800 MHz核磁共振儀進(jìn)行采集。對所有1H NMR 圖譜用Topspin軟件(Bruker biospin, Germany)進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換以及相位、基線調(diào)整，以TSP(δ=0.000)為標(biāo)準(zhǔn)對譜圖進(jìn)行化學(xué)位移的校正。運用AMIX(Bruker biospin, Germany)軟件去除水峰的區(qū)域，并對圖譜進(jìn)行分段積分，將所產(chǎn)生的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。

歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)軟件，進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，包括非監(jiān)督型主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和監(jiān)督型偏最小二乘判別分析(Partial Least-Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)，結(jié)合人類代謝組數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database，HMDB)和相關(guān)文獻(xiàn)，確定潛在的差異代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 1H NMR 多元統(tǒng)計分析

圖1 PCA圖(A)、PLS-DA圖(B)、200次置換實驗圖(C)和OPLS-DA (D)Fig.1 PCA (A), PLS-DA (B), scores plotspermutationtests with 200 iterations (C) and OPLS-DA (D) in 1 H-NMR spectra in liver tissue of mice

采用PCA對所有肝臟樣品1H NMR代謝輪廓進(jìn)行分析，模型組和CTX給藥組的得分圖如圖1A所示，各組間呈現(xiàn)聚類現(xiàn)象，但聚類效果不明顯，故進(jìn)一步采用PLS-DA分析(圖1B)。相應(yīng)的200次排列實驗如圖1C所示，排列實驗結(jié)果顯示數(shù)據(jù)模型成立。基于肝臟代謝圖譜的OPLS-DA分析，有助于分離不同組間的主要代謝物，最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異，尋找出具有特征性的差異代謝物。OPLS-DA得分圖如圖1D所示，可以看出模型組與CTX給藥組沿t[1]軸分開，組間區(qū)分明顯，說明兩組小鼠的肝臟具有代謝差異。

2.2 潛在代謝差異物的確定

根據(jù)OPLS-DA分析，結(jié)合HMDB和相關(guān)文獻(xiàn)初步分析，得到6個潛在腫瘤代謝差異物(見表1)，這些差異代謝物主要歸屬于氨基酸代謝、能量代謝、核酸代謝和脂質(zhì)代謝，其代謝通路圖如圖2所示。

表1 小鼠肝臟提取物代謝譜中主要代謝物的變化

注：“↑”表示CTX組相對于模型組表達(dá)上調(diào)；“↓”表示CTX組相對于模型組表達(dá)下調(diào)。

圖2 肝臟提取物中差異表達(dá)代謝物的代謝通路Fig.2 Metabolic pathways of differentially expressed metabolites in liver extract

3 討 論

腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展往往伴隨著體內(nèi)內(nèi)源性代謝物質(zhì)的變化，而代謝組學(xué)可檢測生物過程的最終產(chǎn)物，監(jiān)測所有影響因素的整體結(jié)果，越來越多的研究利用代謝組學(xué)檢測腫瘤的代謝，分析識別在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中體內(nèi)內(nèi)源性代謝物質(zhì)的改變和相關(guān)代謝通路的變化[10-11]。近年來，腫瘤代謝研究又有了新的進(jìn)展，特別是兩個突出的特點引起了人們的關(guān)注：Warburg效應(yīng)：即使在氧氣存在下，葡萄糖攝取率和乳酸分泌也會增加；谷氨酰胺依賴：高的谷氨酰胺攝取率是細(xì)胞生長所必需的[12]。通過代謝組學(xué)研究體內(nèi)內(nèi)源性代謝物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)腫瘤生物標(biāo)志物，可以深入探索腫瘤的病理機(jī)制，用于腫瘤的診斷和治療。

1959年，CTX被美國FDA批準(zhǔn)為抗癌藥上市，抗瘤譜廣，是目前臨床廣泛應(yīng)用的抗瘤藥物，它在體外無抗腫瘤的活性，進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)一系列代謝后，其中的磷酰胺氮芥發(fā)揮主要的抗腫瘤作用。

已有報道利用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)，研究與CTX相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)譜的化學(xué)免疫治療機(jī)制。研究表明，CTX治療可調(diào)節(jié)大約1000個基因的表達(dá)，這些基因與DNA損傷、壓力、細(xì)胞死亡、危險信號、模式識別受體(PRRs)、細(xì)胞因子、趨化因子和趨化因子受體有關(guān)。CTX還可誘導(dǎo)血漿中多種細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子的釋放[9]。但基因表達(dá)、蛋白質(zhì)表達(dá)和代謝的時間尺度不同，找到因果聯(lián)系較為困難。

為進(jìn)一步了解CTX對體內(nèi)內(nèi)源性代謝物的影響，深入探索CTX對MFC荷瘤小鼠的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制，本實驗對MFC荷瘤小鼠和CTX給藥后的小鼠肝臟進(jìn)行了1H NMR代謝組學(xué)的初步比較分析。實驗結(jié)果顯示，和模型組相比，CTX給藥組的腫瘤塊明顯變小；經(jīng)分析內(nèi)源性差異代謝物，得到6個潛在的腫瘤差異代謝物，進(jìn)而初步揭示CTX抗腫瘤的作用機(jī)制可能與氨基酸代謝、能量代謝、核酸代謝和脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。胃癌多數(shù)情況下是一種“發(fā)現(xiàn)即晚期”的病癥，早期診斷顯得尤為重要；腫瘤生物標(biāo)志物是可以提示腫瘤存在并反映其一定生物特性的生化物質(zhì)，這6個潛在的腫瘤差異代謝物在胃癌的診斷治療中有一定的臨床意義和應(yīng)用價值。

腫瘤的生長對肝、脾、肺、腎、心臟等許多非累及器官的代謝功能會產(chǎn)生影響。肝臟是機(jī)體內(nèi)源性和外源性物質(zhì)代謝和沉積的重要器官，當(dāng)其受到損害時，必定會引起相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)變化，并引起全身代謝紊亂[13]，故本研究選用肝臟樣品進(jìn)行代謝組學(xué)研究。本研究結(jié)果顯示，CTX的抗腫瘤作用可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、能量代謝、核酸代謝和脂質(zhì)代謝通路有關(guān)。

3.1 氨基酸代謝

肝臟是氨基酸代謝的主要場所，氨基酸是合成蛋白質(zhì)所需的基本物質(zhì)，可用于合成癌細(xì)胞生長和增殖所需的蛋白質(zhì)和核苷酸，惡性腫瘤患者體內(nèi)常出現(xiàn)氨基酸代謝異常的現(xiàn)象[14]。此外，氨基酸是癌細(xì)胞自體合成嘌呤和嘧啶的前體物質(zhì)。

脯氨酸與羥脯氨酸等氨基酸是膠原蛋白富含的氨基酸，羥脯氨酸是一種非必需氨基酸，其含量的變化是衡量機(jī)體膠原組織代謝的重要指標(biāo)[15]。Tsai等[16]采用LC-TOF-MS代謝組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者腫瘤組織中的脯氨酸水平降低。羥脯氨酸可由脯氨酸羥化而來，是由膠原和彈性蛋白等結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解得到的一種氨基酸。在本研究中，與模型組相比，CTX給藥組小鼠肝臟中羥脯氨酸的水平升高，提示CTX的抗腫瘤作用可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝有關(guān)。

3.2 能量代謝

丙酮酸代謝是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵。與模型組相比，CTX給藥組小鼠肝臟中，丙酮酸水平降低，說明能量代謝出現(xiàn)了變化。丙酮酸是糖酵解的中間產(chǎn)物，可通過乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞的Warburg效應(yīng)可引起丙酮酸水平升高[17]。在本研究中，丙酮酸水平的降低提示糖酵解過程受到抑制。CTX可能通過抑制糖酵解，調(diào)節(jié)能量代謝，發(fā)揮其抗腫瘤作用。Zhang等[18]基于1H NMR 代謝組學(xué)技術(shù)分析胃癌患者和健康人的組織代謝差異物發(fā)現(xiàn)，胃癌患者腫瘤組織中丙酮酸水平升高。在本研究中，與模型組相比，CTX給藥組小鼠肝臟中丙酮酸水平降低，提示CTX可能通過調(diào)節(jié)丙酮酸水平，從而調(diào)節(jié)能量代謝，抑制腫瘤生長。

3.3 核酸代謝

與模型組相比，CTX給藥組小鼠肝臟肌苷和煙酰胺的水平升高，提示CTX給藥組小鼠肝臟核酸代謝出現(xiàn)了變化，CTX可能通過調(diào)節(jié)核酸代謝抑制腫瘤生長。

研究報道，在腫瘤中肌苷水平顯著下降，這可能是因為核酸的生物合成對DNA和RNA生物合成的需求增加，以確保在腫瘤生長過程中癌細(xì)胞的增殖[19]。本研究中，與荷瘤小鼠相比，CTX給藥后小鼠肝臟肌苷水平明顯升高。肌苷參與體內(nèi)核酸代謝，能量代謝和蛋白質(zhì)合成。肌苷可以直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入人體細(xì)胞，使處于低能缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞恢復(fù)正常水平，繼續(xù)進(jìn)行新陳代謝，并能活化丙酮酸氧化酶類，提高輔酶A的活性，具有激活細(xì)胞，刺激代謝等良好的作用。此外，肌苷是一種天然抗氧化劑，可以減少活性氧的生成，保護(hù)DNA免受活性氧物質(zhì)誘導(dǎo)的氧化損傷[20]，有助于受損肝細(xì)胞功能的恢復(fù)。

煙酰胺是煙酸的酰胺形式，是人體合成輔酶 I 二氫尿嘧啶脫氫酶(Dihydrouracil dehydrogenase, NAD+)的前體物質(zhì)，在糖酵解、檸檬酸循環(huán)和線粒體電子傳遞等基礎(chǔ)能量代謝中起著不可或缺的作用[21]。靶向NAD+代謝可能抑制許多潛在的腫瘤發(fā)展和進(jìn)展機(jī)制，包括增殖、存活、代謝適應(yīng)、侵襲能力、與腫瘤微環(huán)境的異型相互作用以及包括DNA維持和修復(fù)在內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)。

3.4 脂質(zhì)代謝

膽堿是細(xì)胞生物膜的重要組成部分，甘油磷酸膽堿可轉(zhuǎn)化為膽堿。與模型組相比，CTX給藥組小鼠肝臟膽堿和甘油磷酸膽堿的水平升高，說明脂質(zhì)代謝出現(xiàn)了變化。Wang等[22]利用基于1H NMR的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組織中膽堿水平顯著降低，提示膽堿可能為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供合成細(xì)胞膜的成分。CTX給藥組小鼠肝臟膽堿水平升高，說明CTX可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抑制腫瘤生長。

4 結(jié) 論

CTX給藥后，MFC荷瘤小鼠肝臟多種代謝物水平發(fā)生變化，提示CTX的抗腫瘤作用可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝、能量代謝、核酸代謝和脂質(zhì)代謝等代謝通路有關(guān)，為后續(xù)研究提供參考。

本實驗尚存在一定的局限性。本研究僅對MFC荷瘤小鼠和CTX干預(yù)10天的小鼠肝臟代謝物的變化進(jìn)行研究，今后實驗可以考慮，設(shè)置多個時間點收集肝臟樣品，對其代謝物進(jìn)行動態(tài)分析，從而得到更全面的代謝物變化信息。此外，本研究僅選用1H NMR進(jìn)行分析，后續(xù)研究可結(jié)合其他代謝組學(xué)技術(shù)，如LC-MS，GC-MS等，將采用不同的代謝組學(xué)技術(shù)得出的結(jié)果進(jìn)行相互驗證。