循環(huán)腫瘤DNA在腎細(xì)胞癌診療中的應(yīng)用進(jìn)展

龐亮 胡鐵良

天津市職業(yè)病防治院，天津市工人醫(yī)院泌尿外科 300011

0 引 言

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是一種高度侵襲性和化療耐受性的疾病，由于其對放療的反應(yīng)也很差，因此通常需通過手術(shù)切除來治療[1-2]。重要的是，治療后超過30%的患者局部RCC 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[3]。即使在被認(rèn)為可通過根治性腎切除術(shù)治愈的RCC 病例中，手術(shù)后5～10年仍可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。在過去的幾十年中，使用細(xì)胞因子的非特異性免疫療法已廣泛用于治療轉(zhuǎn)移性RCC，但由于其在提高患者中位生存率方面取得的成功有限，現(xiàn)在正逐漸被靶向免疫療法取代[5]。目前，在臨床實踐中常規(guī)使用的RCC 靶向療法，如免疫檢查點抑制劑、mTOR 抑制劑或VEGF 酪氨酸激酶抑制劑，但尚未使用預(yù)測性生物標(biāo)志物來指導(dǎo)這些靶向療法的選擇[6]。在這種情況下，迫切需要可靠的RCC 生物標(biāo)志物，以實現(xiàn)早期診斷、預(yù)后和監(jiān)測治療效果以及疾病的潛在復(fù)發(fā)。

近些年，液體活檢技術(shù)發(fā)展迅猛，如：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell, CTC）和無細(xì)胞核酸（即循環(huán)無細(xì)胞DNA），循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），循環(huán)無細(xì)胞RNA 或細(xì)胞外囊泡，已成為監(jiān)測癌癥患者（包括RCC）疾病狀態(tài)的潛在工具，并受到極大關(guān)注[7]。本綜述重點對ctDNA 在RCC診療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 ctDNA 分析概述

無組織的DNA 在某些情況下可在血液中釋放，如在炎癥狀態(tài)或懷孕時。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，癌癥患者的ctDNA 濃度更高[8]。目前尚不清楚ctDNA 如何釋放到血液中，但先前的研究表明其來源可能是壞死和/或凋亡引起的細(xì)胞裂解[9]。它是腫瘤特異性的，并提供有關(guān)腫瘤細(xì)胞片段化DNA及其特異性突變的分子線索[10]。隨著高通量測序和液體活檢技術(shù)的迅速發(fā)展，血漿中存在的ctDNA 已逐漸成為組織的替代品[11]。ctDNA 中的全基因組拷貝數(shù)的不穩(wěn)定性分析提供了一種合適的方法，從而可量化染色體不穩(wěn)定性并預(yù)測癌癥的治療反應(yīng)[12-13]。為實現(xiàn)RCC 的早期診斷、預(yù)后和監(jiān)測治療效果以及疾病的復(fù)發(fā)提供了有力的支持。

2 ctDNA 的定性分析

Pal 等[14]分析了 220 例轉(zhuǎn)移 RCC（metastatic RCC,mRCC）患者的ctDNA。有79%的患者檢測到基因改變，其中最常見的是 TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和 ARID1A（12%），并以單核苷酸變異為主。他們還比較了在一線藥物治療的患者（舒尼替尼和帕唑帕尼）和二線藥物治療的患者（尼古盧單抗，依維莫司，阿昔替尼和卡博替尼）的ctDNA 分析中檢測到的基因改變。并注意到TP53（49%vs 24%，P=0.02）、NF1（20%vs 3%，P=0.01）發(fā)生了改變。這些發(fā)現(xiàn)提出了這樣的假設(shè)，即某些基因改變可能是治療中選擇性壓力的結(jié)果，并且可能在治療耐藥性中起作用。

在已知與治療敏感性相關(guān)的分子途徑中尋找與指導(dǎo)治療決策相關(guān)的特定突變。對依維莫司的敏感性似乎與TSC1/TSC2/mTOR 改變有關(guān)。不論組織學(xué)如何，在有臨床獲益的患者中和非臨床獲益的患者中均發(fā)現(xiàn)了這些突變的發(fā)生[15]。Voss 等[16]在5 例mRCC 接受mTOR 抑制劑治療的患者中，發(fā)現(xiàn)在TSC1 和mTOR 中存在對mTOR 信號具有激活作用的基因組改變，此為異常的治療反應(yīng)提供了合理的解釋。TSC1 和TSC2 可能被篩選為在以VEGF 為靶點治療的RCC 患者中依維莫司反應(yīng)的預(yù)測生物標(biāo)志物。

已鑒定了與侵襲性腫瘤行為相關(guān)的特定突變或一組突變，如 SETD2（ccRCC 的 15%）、PBRM1（40%）、BAP1（15%）、KDM5C（7%）、MTOR（5%～6%），可以考慮未來使用液體活檢來指導(dǎo)治療相關(guān)的mRCC[17-19]。乳頭狀 1 型 RCC 與 MET 基因改變有關(guān)，而乳頭狀2 型RCC 的特征在于CDKN2A、SETD2、NF2、CUL3，TERT 突變[20]。患有遺傳性平滑肌瘤和RCC 綜合征的富馬酸水合酶基因突變的患者有可能發(fā)生2 型乳頭狀RCC[21]。

3 ctDNA 在局限性腎細(xì)胞癌中的應(yīng)用

盡管25%的RCC 患者在就診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，但另外20%～40%的局限性RCC 患者最終會發(fā)展成mRCC 患者[1,22]。RCC 中轉(zhuǎn)移的時間和位置很難預(yù)測，這使得監(jiān)測變得困難。早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病可能會改善臨床結(jié)局。ctDNA 有潛力作為腎切除術(shù)后局限性RCC 患者的監(jiān)測生物標(biāo)志物。Al-Qassab 等[23]研究了一些預(yù)后基因以及RCC 中其他常見突變的基因，從而創(chuàng)建了一個由14 個基因組成的小組。在此項針對30 例準(zhǔn)備腎切除術(shù)的RCC 患者的研究中，ctDNA 二代測序（next-generation sequencing, NGS）被用于檢測這14 個常見的突變基因。30 名術(shù)前RCC 患者中有20 名在所有檢測基因中均具有可檢出基因改變。即使是早期疾病且腫瘤大小僅為1.1×0.7×0.5 cm3的患者，也可檢測到ctDNA 突變。這表明即使在局限性RCC 中低腫瘤負(fù)擔(dān)的患者也可定量檢測到ctDNA。

另一項研究使用實時定量PCR 來檢測92 例不同階段的透明細(xì)胞RCC 患者的ctDNA 水平[24]。研究者發(fā)現(xiàn)，mRCC 患者的ctDNA 高于局限性RCC（6.04 vs 5.29，P=0.017）。研究還表明，RCC 的復(fù)發(fā)具有較高的ctDNA 水平（P=0.024）。這些研究結(jié)果表明，可按設(shè)定的時間間隔定期監(jiān)測ctDNA，以監(jiān)測疾病的復(fù)發(fā)情況。ctDNA 的使用可減少與篩查CT 掃描相關(guān)的潛在危害，包括造影劑腎病和放射線照射。

在局限性RCC 中，少數(shù)研究已報道了ctDNA 在疾病監(jiān)測中的新用途。Hauser 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與健康患者相比，RCC 中ctDNA 的CPG 島超甲基化很常見，并且可作為RCC 初始診斷的潛在生物標(biāo)志物。在另一項研究中，研究人員分析了整個RCC 各階段的基因組和線粒體ctDNA 濃度。他們使用基因組和線粒體ctDNA 的組合，為RCC 開發(fā)了新的診斷和預(yù)后模型[26]。當(dāng)然，這兩種使用ctDNA 的新技術(shù)都需在更大的隊列中進(jìn)行進(jìn)一步驗證，以更清楚地描述其臨床用途。

4 ctDNA 在轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌中的應(yīng)用

4.1 轉(zhuǎn)移性腎癌中ctDNA 的突變

對于mRCC，臨床實踐中常規(guī)使用靶向療法，如VEGF 酪氨酸激酶抑制劑或mTOR 抑制劑，但尚沒有預(yù)測性的生物標(biāo)志物指導(dǎo)這些靶向療法的選擇。隨著液體活檢技術(shù)的發(fā)展，mRCC 中的ctDNA 可作為免疫治療反應(yīng)的生物標(biāo)記物。一項對220 名mRCC患者的大型研究首次評估了mRCC 中ctDNA 的突變情況[14]。在該研究中，檢測了ctDNA 中的基因改變。在評估的220 名患者中，在78.6%的患者中至少檢測到一種基因改變，表明mRCC 脫落了可檢測量的ctDNA。在ctDNA 中檢測到最常見的基因改變是TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和ARID1A（12%）。與之前TCGA 中組織NGS 檢測的RCC 研究對照相比，此研究RCC 中檢測到的基因改變的情況相似；但是，兩項研究之間基因改變的頻率有所不同。如，在TCGA 研究中，ctDNA 隊列中只有不到3%的患者有TP53 改變，而此研究ctDNA隊列中有35%的患者有TP53 改變[27]。腫瘤組織和ctDNA 的NGS 研究之間的基因改變頻率差異可能是由于患者人群的差異（即局限性與轉(zhuǎn)移）所致。這項研究表明ctDNA 的NGS 可提供mRCC 中存在的突變的特征。

由于ctDNA NGS 能夠檢測多線治療后的變化情況，因此ctDNA 可用于符合生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床試驗條件的患者。生物標(biāo)記物指導(dǎo)的臨床試驗已在mRCC 中使用，并且有望應(yīng)用更加普遍。如，MET 的改變在1 型乳頭狀RCC 中很常見[20]。在沃利替尼用于pRCC 的Ⅱ期臨床試驗中，MET 引起的乳頭狀RCC 對治療表現(xiàn)出強(qiáng)烈的反應(yīng)，而非MET 引起的乳頭狀 RCC 缺沒有反應(yīng)（P=0.002）[28]，因此 ctDNA 可用于此生物標(biāo)記物指導(dǎo)的臨床試驗中。

腫瘤組織和ctDNA NGS 檢測到的基因改變的比較來自于對19 例mRCC 患者的研究[29]。當(dāng)分析兩個測試中檢測到的基因改變時，組織和ctDNA 之間檢測到的基因改變的中位數(shù)相似（中位數(shù)3.0 vs 1.0，P=0.14）；但是，兩個測試之間的一致性比率僅為8.6%。該研究的臨床實用性受到組織與ctDNA NGS 之間檢測時間的限制。在其他惡性腫瘤的研究中，研究者控制了兩次檢查之間的時間，結(jié)果所報告的一致率更高[30]。然而，ctDNA 和組織NGS 之間的顯著不一致也可能反映了患者體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性。2012年，對4 名mRCC 患者的研究中，同一患者多個部位的活檢顯示體細(xì)胞改變具有明顯的空間異質(zhì)性[31]。ctDNA 可能比組織的NGS 更準(zhǔn)確地反映了患者體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性，并且可能更準(zhǔn)確地識別了突變。這將使ctDNA 成為鑒定有新的轉(zhuǎn)移的理想測試。

4.2 ctDNA 與影像學(xué)

在大多數(shù)臨床情況下，每3 個月使用CT 監(jiān)測mRCC 患者的胸部/腹部/骨盆。反復(fù)進(jìn)行CT 掃描既耗時、成本高昂，又使癌癥患者遭受高劑量的輻射。ctDNA 有潛力替代mRCC 中的這些檢查。在最近的一項針對34 例mRCC 患者的研究中，可檢測到ctDNA 的患者比未檢測到ctDNA 的患者具有更高的影像學(xué)負(fù)擔(dān)（P=0.01）[32]。盡管這些發(fā)現(xiàn)表明ctDNA具有補(bǔ)充或替代mRCC 患者頻繁進(jìn)行CT 掃描的能力，但這些結(jié)果來自一項小型回顧性研究，尚需在較大的人群中進(jìn)行進(jìn)一步評估。

4.3 ctDNA 與腫瘤突變負(fù)荷

納武單抗（Nivolumab）是針對PD-1 的單克隆抗體，目前已批準(zhǔn)用于mRCC 的挽救性治療[33]。預(yù)計更多的免疫檢查點抑制劑將在不久的將來獲得治療mRCC 的批準(zhǔn)。最近的研究顯示，與單獨使用舒尼替尼進(jìn)行mRCC 的一線治療相比，納武單抗加伊匹單抗（ipilimumab）的組合改善了總生存期（OS）[34]。而且，一線研究中正在研究免疫檢查點抑制劑和靶向治療的許多組合。臨床上并沒有使用可預(yù)測對免疫檢查點抑制劑有較好應(yīng)答的生物標(biāo)志物，但它們可幫助mRCC 等惡性腫瘤制定個性化的治療順序。ctDNA 已顯示出作為免疫檢查點抑制劑的預(yù)測生物標(biāo)記物的潛力。

納武單抗最近被批準(zhǔn)用于治療任何具有錯配修復(fù)缺陷的癌癥[35]。具有錯配修復(fù)缺陷的腫瘤具有異常高的腫瘤突變負(fù)荷。最近的一項研究表明，ctDNA 可以替代腫瘤突變負(fù)荷[36]。在對69 名患者的實體瘤研究中，包括3 名mRCC 的患者，均接受了免疫檢查點抑制劑（定義為≥6 個基因改變ctDNA）治療。預(yù)測客觀緩解率（40.9%vs 15.9%，P=0.025）和無進(jìn)展生存（2.85 vs 2.19 m，HR=0.59，P=0.025）改善。這些結(jié)果清楚地表明，ctDNA 中更多的基因改變可替代高腫瘤突變負(fù)荷，并且可預(yù)測對免疫檢查點抑制劑的反應(yīng)。

有一項獨特的病例報告證明了ctDNA 作為mRCC對免疫療法反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物的價值[37]。一名44 歲的男子被診斷出患有mRCC，他的腦部發(fā)生孤立性轉(zhuǎn)移。依次用大劑量白介素-2、帕唑帕尼、貝伐單抗、尼古魯單抗加依匹莫單抗和卡博替尼治療?？ú┨婺嶂委熀?，評估了ctDNA NGS 并顯示出大量的基因改變；而后又使用了納武單抗，之后的ctDNA NGS 沒有可檢測到的基因改變。這個案例說明了ctDNA 在mRCC 治療中的兩個潛在作用：第一，與先前討論的研究一致，ctDNA 中的大量基因改變可替代高腫瘤突變負(fù)荷，并預(yù)測對免疫療法的反應(yīng)；第二，開始治療后在ctDNA 中檢測到的基因改變數(shù)量可能反映了治療反應(yīng)。這種觀察尚需在更大的隊列中進(jìn)一步驗證。

5 新技術(shù)

盡管液體活檢在臨床上日益受到重視，但由于目前ctDNA 檢測方法的局限性，某些設(shè)置（如癌癥篩查）無法從這種無創(chuàng)技術(shù)中受益。尤其是ccfDNA和ctDNA 之間的區(qū)別需要一種高度敏感的技術(shù)。為此，加拿大的一個小組開發(fā)了一種新的基于免疫沉淀的方案，以分析少量ccfDNA 的甲基化。他們發(fā)現(xiàn)，通過低成本、高效率的方法，可檢測癌癥特異性差異甲基化區(qū)域（DMR），從而可提高ctDNA 檢測的靈敏度[38]。

6 結(jié)語與展望

液體活檢在臨床中的應(yīng)用為新的研究領(lǐng)域鋪平了道路。目前雖然可以使用組織和ctDNA 進(jìn)行預(yù)測性標(biāo)志物的鑒定、預(yù)后和分子亞型的分類，但隨時間推移追蹤克隆的改變，及早發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制，監(jiān)測治療反應(yīng)，檢測復(fù)發(fā)卻僅能以無創(chuàng)方式的液體活檢才有可能。

目前正在研究實施液體活檢的許多問題和挑戰(zhàn)，以及新興的液體活檢分析物（如細(xì)胞外囊泡、循環(huán)無細(xì)胞RNA、支鏈氨基酸、蛋白質(zhì)、腫瘤相關(guān)的血小板），采用開發(fā)綜合的多維分析方法對于解決這些挑戰(zhàn)至關(guān)重要。

ctDNA 的NGS 檢測是一項新穎的技術(shù)，它有可能通過提供腫瘤突變情況來改變臨床實踐。在局限性RCC 中，ctDNA 有潛力作為腎切除術(shù)后疾病復(fù)發(fā)的篩查工具。在mRCC 中，ctDNA 有望作為對免疫治療反應(yīng)的預(yù)測性生物標(biāo)志物。此外，ctDNA 可為全身性治療后的評估提供支持。在RCC 的所有階段中，液體活檢對患者都具吸引力，因為它們均屬無創(chuàng)檢查，且可連續(xù)重復(fù)進(jìn)行而不會對患者造成重大傷害。目前，已經(jīng)有越來越多ctDNA 的相關(guān)研究應(yīng)用于臨床試驗[39-42]，而隨著技術(shù)的不斷革新，更加準(zhǔn)確且穩(wěn)定的檢測方法將被不斷的開發(fā)出來，并進(jìn)入臨床試驗驗證。相信未來，ctDNA 有可能影響腎細(xì)胞癌的診斷和治療，其臨床應(yīng)用前景將更加廣闊。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突