破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞皮下移植瘤生長增殖的影響＊

鐘志如，羅序亮，劉學(xué)艷，林蘭，王琳，李志斌

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院乳腺外科，南昌330006；2.江西省共青城市人民醫(yī)院外科，九江330401)

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的癌癥， 也是死亡率第一的癌癥[1,2]。乳腺癌的內(nèi)分泌治療是雌激素受體陽性乳腺癌患者綜合治療的重要組成部分， 主要包括拮抗雌激素受體類藥物， 他莫昔芬(Tamoxifen ，TAM)憑借其低毒、經(jīng)濟(jì)、效應(yīng)作用持久成為ER+乳腺癌患者綜合治療的一線藥物[3]。 目前中藥作為乳腺癌輔助治療手段之一越來越受到重視。靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實體，靈芝孢子粉是靈芝的生殖細(xì)胞，擁有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤等多種功能[4-6]。 多項研究顯示，靈芝孢子粉能通過各種途徑如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等達(dá)到治療腫瘤的目的[7]，并且已有大量應(yīng)用靈芝孢子粉治療各種腫瘤的研究報道[8-10]。 本研究旨在觀察破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬對人乳腺癌裸鼠移植瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性BALB/c-nu 裸鼠共40 只，4-6 周齡，體重18-25g，從湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司購入， 裸鼠生產(chǎn)許可證號：SCXK （湘）2013-0004，使用許可證號：SYXK（贛）2017-0002，在SPF條件下飼養(yǎng)于南昌樂悠生物科技有限公司。 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞庫提供。 實驗中使用的破壁靈芝孢子粉，其經(jīng)銷方為北京萬世堂中醫(yī)科學(xué)研究院 （每100g 含粗多糖0.60g，批準(zhǔn)文號：國食健字G20110430，衛(wèi)生許可證號：魯衛(wèi)食證字（2007）第370000-000350 號）購買，性狀為棕色細(xì)小粉末，實驗時以生理鹽水配制成懸濁液。 實驗用乳腺癌內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬（分子式：C26H29NO，CAS 登錄號：10540-29-1，EINECS 登錄號:234-118-0） 由南昌樂悠生物科技有限公司提供，為白色粉末，實驗時用生理鹽水配制成懸濁液。RPMI 1640 培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA 胰酶等購自Solarbio 公司。 胎牛血清 （北美） 購自Gibco 公司。 湖南湘儀低速多管離心機(jī)TDZ5-WS（濟(jì)南云鵬醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和單細(xì)胞懸液的制備 細(xì)胞株MCF-7 復(fù)蘇后置于含 10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中， 在37℃、 含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，適時傳代。 取對數(shù)生長期細(xì)胞， 經(jīng)Trypsin-EDTA 胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，1000r/min離心5 min，用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并將細(xì)胞的濃度調(diào)至為2.5 ×107/ml,將細(xì)胞懸液裝于5ml無菌ep 管中備用。

1.2.2 動物模型建立、 動物分組及給藥方法 用1ml 注射器注射0. 2ml 的上述細(xì)胞懸浮液于每只裸鼠的右前肢肩胛部皮下。接種12 d 后，可見接種處微小隆起，并逐漸增大。 60 只裸鼠中有44 只出現(xiàn)腫塊，接種成功率為73.3% 。 接種后2 周將44只移植瘤接種成功的裸鼠隨機(jī)分成4 組， 每組11只。 分組完成后開始給各組小鼠用藥，以灌胃的形式模擬口服給藥： 破壁靈芝孢子粉組500mg/kg 灌胃，1 次/d；他莫昔芬組4.6mg/kg 灌胃，次/2d；破壁靈芝孢子粉與他莫昔芬組聯(lián)合組同時給予破壁靈芝孢子粉和他莫昔芬 （濃度和給藥方法同上）；對照組相同體積的生理鹽水灌胃，1 次/d；連續(xù)21d。

1.2.3 觀察裸鼠成瘤情況 用藥后觀察裸鼠的一般狀況， 包括日常活動、精神狀態(tài)、體重變化。 每3d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑( a)和短徑( b)，計算腫瘤體積( V),V =ab2 /2。 藥物處理21d 后,脫頸椎處死裸鼠，完整剝離腫瘤， 并稱量重量和測量瘤體的體積。計算抑制率: 抑制率= ( 1－實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重) ×100% 。 最后，將小鼠腫瘤使用10%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)機(jī)械切片，厚度為4μm。

1.2.4 觀察瘤體HE 染色 切片后的腫瘤組織分別利用HE 染色及免疫組化染色：四組腫瘤組織均經(jīng)10%福爾馬林固定、切片、酒精脫水后以石蠟包埋，二甲苯脫蠟、酒精至水、經(jīng)過蘇木精-伊紅染色（HE染色），HE 染色后的切片在不同倍數(shù)的光鏡下觀察并描述和記錄細(xì)胞改變情況。

1.2.5 觀察瘤體免疫組化染色情況 四組標(biāo)本均采用免疫組化二步法檢測石蠟標(biāo)本切片中的ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四種指標(biāo)的表達(dá)，抗體和試劑盒均購自南昌樂悠生物科技有限公司， 以已知乳腺癌陽性切片為陽性對照， 以PBS 代替一抗作陰性對照，染色步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

免疫組化染色包括ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 四種指標(biāo)， 觀察并記錄每一種指標(biāo)的表達(dá)情況，并進(jìn)行計算對比。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：ER-α、ER-β、Ki-67 以及P53 陽性信號均分布于細(xì)胞核中，以出現(xiàn)黃色至棕色顆粒為陽性表現(xiàn)， 計算陽性細(xì)胞百分比，定量判定結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用Prism 7.0 software (GraphPad, San Diego CA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果以±sD 表示，P＜0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況 用藥前各組裸鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0．05)。整個實驗過程中所有裸鼠均活動良好，大小便及飲食正常，對外界刺激有良好的反應(yīng)，無死亡。 破壁靈芝孢子粉組和聯(lián)合組小鼠精神狀態(tài)較對照組和他莫昔芬組更好。

圖1 各組裸鼠（n=11）：對照組；破壁靈芝孢子粉組；他莫昔芬組；聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）實驗期間小鼠體重變化

2.2 裸鼠體內(nèi)乳腺癌移植瘤生長的影響 用藥前各組腫瘤體積無顯著差異( P＞0．05)，每周測量腫瘤體積2 次以動態(tài)觀察腫瘤生長情況， 用藥后對照組移植瘤體積進(jìn)行性增大， 而他莫昔芬和靈芝孢子粉組移植瘤體積增大稍緩慢， 聯(lián)合用藥組增大尤其緩慢（圖2）。 與對照組相比，各用藥組移植瘤體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)，而聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0．05)，單藥組之間無顯著差異( P＞0．05)。給藥結(jié)束后將各組裸鼠安樂死，剝離裸鼠移植瘤（圖2），對其移植瘤進(jìn)行稱重，比較各組平均瘤重，各實驗組瘤重均低于對照組，其中破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組平均瘤重最低，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。 計算并比較各組抑瘤率，其中破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組抑瘤率高于破壁靈芝孢子粉和他莫昔芬組（表1）。

2.3 各組瘤體組織形態(tài)學(xué)改變 將各組裸鼠移植瘤組織切片通過HE 染色光鏡下可見對照組移植瘤細(xì)胞明顯異型性：上皮排列失去極性，細(xì)胞核形態(tài)改變，大小不一，染色顏色較深，染色質(zhì)糾結(jié)形成團(tuán)塊，圖像中可見明顯核仁，多見核分裂像。 破壁靈芝孢子粉組、 他莫昔芬組移植瘤細(xì)胞異型性較低， 出現(xiàn)紅染無結(jié)構(gòu)壞死區(qū)， 出現(xiàn)凋亡腫瘤細(xì)胞，聯(lián)合組即破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組異型性最低，組織結(jié)構(gòu)明顯疏松，可見明顯紅染無結(jié)構(gòu)的壞死區(qū)，其面積較另外三組明顯增大，腫瘤細(xì)胞核深染、固縮、崩解，凋亡腫瘤細(xì)胞最多。 （圖3）。

圖2 各組裸鼠（n=11）：對照組；破壁靈芝孢子粉組；他莫昔芬組；聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）移植瘤生長曲線（A）；各組裸鼠移植瘤重量對比（B）及移植瘤示意圖（C）

表1 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

圖3 各組裸鼠移植瘤切片HE 染色對比：A.對照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

2.4 各組免疫組化測量ERα、ERβ、Ki-67 及P53的陽性表達(dá)情況 顯微圖像分析ERα 陽性信號分布于細(xì)胞核中，出現(xiàn)黃色至棕色為陽性表現(xiàn)，在實驗組、靈芝組、他莫昔芬組、聯(lián)合組胞核內(nèi)均未見黃色顆粒，呈陰性表達(dá)（圖4）。

顯微圖像分析ERβ 陽性信號以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色為陽性，在對照組、靈芝組、他莫昔芬組及聯(lián)合組胞核內(nèi)可見少量棕黃色顆粒，其中聯(lián)合組ERβ 表達(dá)最低， 陽性率表達(dá)為17.14%，對照組ERβ 陽性表達(dá)為33.26%,靈芝組ERβ 陽性表達(dá)率為37.00%,而在他莫昔芬組之中為30.35%，四組差別無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.153>0.05）（圖5）。

Ki-67 為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕色為陽性，四組中胞核內(nèi)均可見黃色至棕色顆粒， 其中對照組中Ki-67 陽性率表達(dá)為43.60%， 靈芝組為35.83%，他莫昔芬組為37.14%，聯(lián)合組Ki-67 陽性表達(dá)率為47.50%，4 組差別無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.136>0.05）（圖6）。

P53 為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色至棕色為表達(dá)陽性，在對照組、靈芝組、他莫昔芬組及聯(lián)合組胞核內(nèi)可見淡黃色至棕黃色顆粒， 其中對照組P53 陽性率表達(dá)為84.17%， 靈芝組P53 陽性表達(dá)為90.77%，他莫昔芬組P53 陽性表達(dá)率為87.50%， 聯(lián)合組P53 陽性表達(dá)率為66.67%， 該差別有意義 （P=0.006<0.05）（圖7）。

3 討論

圖4 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化ERα 對比：A.對照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖5 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化ERβ 對比：A.對照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖6 各組Ki-67 對比：A.對照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

圖7 各組裸鼠移植瘤切片免疫組化P53 對比：A.對照組；B.破壁靈芝孢子粉組；C.他莫昔芬組；D.聯(lián)合組（破壁靈芝孢子粉+他莫昔芬組）

靈芝孢子是靈芝生長成熟期從菌蓋彈射出來的象淡霧狀的極其微小的孢子， 其主要成分有靈芝多糖、三萜類化合物、生物堿類、多肽及微量元素鋅、鍺、硒等，大量研究證明，靈芝孢子粉具有免疫抗腫瘤作用[11-14]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[15]、抑制腫瘤血管生成[16,17]、 抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[18]，GLS 抗腫瘤作用還可能與抑制TOPⅠ，TOPⅡ異構(gòu)酶， 抑制腫瘤細(xì)胞端粒酶有關(guān)[19]。 本實驗建立人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞皮下移植瘤細(xì)胞模型，觀察靈芝破壁孢子粉與他莫昔芬對乳腺癌移植瘤模型的影響。 本次研究結(jié)果顯示，破壁靈芝孢子粉能夠抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖，聯(lián)合使用他莫昔芬對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長增值的抑制作用更加顯著， 而這二者聯(lián)合使用能夠下調(diào)P53 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而繼續(xù)影響乳腺癌預(yù)后，然而二者聯(lián)合使用能夠使P53 蛋白表達(dá)下調(diào)這一點(diǎn)并未在以往的實驗中引起關(guān)注。

P53 是重要的抑癌基因， 包括野生型和突變型，研究證明，野生型P53 可 抑制細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S 期，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞在新的周期復(fù)制或程序性細(xì)胞死亡中得到修復(fù)或恢復(fù)，從而抑制腫瘤的發(fā)生[20]。 由于野生型P53蛋白半衰期短，容易降解，所以檢測出的都是是突變型P53 蛋白。 P53 抑癌基因的突變或P53 蛋白的過度表達(dá)都提示預(yù)后不良[21]。 研究表明，P53 腫瘤蛋白表達(dá)越高, 越有可能發(fā)生淋巴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22]。而本實驗中正是對突變型P53 蛋白進(jìn)行免疫組化檢測證實,破壁靈芝孢子粉聯(lián)合他莫昔芬可以顯著降低P53 蛋白表達(dá)，提高乳腺癌的整體預(yù)后情況。

相比較于作為內(nèi)分泌治療首選用藥的他莫昔芬容易耐藥、副作用多等缺點(diǎn)，本研究中使用的破壁靈芝孢子粉作為中醫(yī)藥抗癌，具有價格低廉、副作用少、可接受度高、改善癥狀以及 調(diào)節(jié)免疫等優(yōu)點(diǎn)。 應(yīng)用中醫(yī)藥抗癌、預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移及改善惡性腫瘤預(yù)后，相對具有優(yōu)勢。 本實驗驗證破壁靈芝孢子粉具有一定抑制腫瘤生長作用的同時， 預(yù)測了內(nèi)分泌治療期間聯(lián)合使用破壁靈芝孢子粉可能達(dá)到改善患者預(yù)后的作用。 有研究證明，經(jīng)過放療、化療及手術(shù)的乳腺癌患者， 除卻治療本身帶來的影響之外，還有可能會出現(xiàn)，諸如疲勞、疼痛、焦慮和抑郁的癥狀。 而靈芝孢子粉對于此類患者患者可能有益，而并未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[23]。 破壁靈芝孢子粉與他莫昔芬聯(lián)合使用雖未明顯的增加其抗腫瘤效果， 但能夠顯著降低腫瘤P53 的表達(dá)從而存在潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果。 破壁靈芝孢子粉的功效仍然是可以值得肯定的， 在臨床治療中也將會有更加廣闊的應(yīng)用前景。