酶消化法分離和培養(yǎng)人源原代跟腱干細(xì)胞*

郭東昇 佘遠(yuǎn)時 李慧 解敏 虞宵 儲文亞 張向鑫 陳廣祥 王東來*

跟腱斷裂好發(fā)于運(yùn)動活躍的中青年患者，是常見的骨科及運(yùn)動醫(yī)學(xué)疾病。跟腱損傷后，依靠自然愈合只能形成排列錯亂的膠原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)，無法恢復(fù)正常的生物力學(xué)功能[1]。同時，修復(fù)后的跟腱仍有較高的再斷裂發(fā)生率[2]。理想的治療手段既要增強(qiáng)跟腱組織的再生能力，同時也要促進(jìn)跟腱的愈合進(jìn)程，減少跟腱粘連的發(fā)生。近年來，以細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程在醫(yī)療領(lǐng)域飛速發(fā)展，目前已知很多種類細(xì)胞均可作為跟腱修復(fù)的潛在細(xì)胞來源，如成纖維細(xì)胞[3]、間充質(zhì)干細(xì)胞[4-5]、腱細(xì)胞[6]和脂肪來源干細(xì)胞[7]。然而到目前為止，國內(nèi)外仍沒有研究者對人胎兒跟腱干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定。亦沒有研究者對胎兒來源跟腱干細(xì)胞的蛋白表達(dá)進(jìn)行探索。本研究旨在探索分離培養(yǎng)人胎兒跟腱干細(xì)胞的有效辦法，并對跟腱干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，從而為臨床治療跟腱損傷提供更優(yōu)選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 組織及細(xì)胞來源

本研究所使用的胎兒組織均嚴(yán)格按照倫理學(xué)要求進(jìn)行，流產(chǎn)胎兒來源為患有嚴(yán)重心臟畸形無法治愈而選擇流產(chǎn)者?；颊呒覍倬炇鹬橥鈺?，且得到了本院倫理委員會的批準(zhǔn)（倫理審查號：K-2019-006-H01）。本實驗所使用的陽性對照細(xì)胞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs）為本中心實驗室惠贈。

1.1.2 實驗試劑及耗材

細(xì)胞培養(yǎng)瓶/細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），I 型膠原酶（Sigma 公司，美國），中性蛋白酶（Roche 公司，美國），兔抗人CollagenⅠ抗體（Proteintech 公司，中國），兔抗人Collagen Ⅱ抗體（Proteintech公司，中國），兔抗人Collagen Ⅲ抗體（Proteintech公司，中國），兔抗人Tensacin-c 抗體（abcam 公司，美國），兔抗人SCXA 抗體（abgent 公司，中國），兔抗人GAPDH抗體（Proteintech 公司，中國），人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨/成骨/成脂肪誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（廣州賽業(yè)生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國），qPCR試劑盒（Thermo Fisher 公司，美國），F(xiàn)ITC anti-human CD34/CD44/CD45/CD90 抗體（BioLegend 公司，美國）。

1.1.3 實驗儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher 公司，美國），超凈工作臺（藝思高科技公司，新加坡），流式細(xì)胞儀（Beckman 公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人胎兒來源跟腱干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

取孕20 周流產(chǎn)新鮮胎兒，在無菌條件下取出雙側(cè)跟腱組織，仔細(xì)剔除跟腱腱鞘、腱周膜組織。無菌PBS 沖洗跟腱組織3 次，將跟腱組織置于0.25%濃度的胰蛋白酶中室溫下預(yù)消化10 min。將預(yù)消化后的肌腱組織剪成1 mm3大小，加入組織消化液，消化液成分為3 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL 的中性蛋白酶。置于培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min。消化后用70 m 細(xì)胞篩過濾，PBS 清洗細(xì)胞2 次。以稍低密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)液成分為10%胎牛血清+100 U/mL 青鏈霉素+90%低糖DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為:37℃、5%CO2。

1.2.2 CCK-8 法檢測人源跟腱干細(xì)胞的增殖能力

分別取P1、P2、P3 代細(xì)胞消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個/mL。96 孔板每孔加100 L 細(xì)胞懸液（每孔含2 000 個細(xì)胞），每組設(shè)置6 個復(fù)孔，37℃、5%二氧化碳濃度條件下培養(yǎng)。分別于細(xì)胞培養(yǎng)第1、3、5、7 d，每孔加入10 L CCK-8 溶液，放回培養(yǎng)箱孵育1 h。用酶標(biāo)儀分別測定450 nm 吸光度，記錄并繪制增殖曲線。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測人源跟腱干細(xì)胞表面標(biāo)志物

取P3 代細(xì)胞，消化后離心，用預(yù)冷的PBS 制備成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×105cells/cm2密度，按量加入抗體（CD34、CD44、CD45、CD90），避光在飽和濕度下孵育30 min，完成后，每管細(xì)胞加入2 mL PBS 清洗，1 000 rpm離心5 min 后去掉上清，加入0.3 mL PBS 重懸，上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀每個樣品檢測10 000 個門內(nèi)細(xì)胞。

1.2.4 人源跟腱干細(xì)胞及人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能的鑒定

成骨誘導(dǎo)分化：取P3 代2 種細(xì)胞，按前述方案培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至65%時，換用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每3 d 換液1 次。連續(xù)誘導(dǎo)21 d 后，將細(xì)胞固定后用茜素紅進(jìn)行細(xì)胞染色；成脂誘導(dǎo)分化：取P3 代2 種細(xì)胞，按前述方案培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至100%或者過度融合后，換用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A 液。誘導(dǎo)3 d 后換用成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B 液，24 h 后，換回A 液繼續(xù)進(jìn)行誘導(dǎo)。交換作用5 次后，用B液維持培養(yǎng)7 d，將細(xì)胞固定后用油紅O 染色；成軟骨誘導(dǎo)分化：取P3 代2 種細(xì)胞約3×105個細(xì)胞離心后用軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸，再次離心得到細(xì)胞微球，直接將細(xì)胞微球置于0.5 mL 軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，持續(xù)誘導(dǎo)21 d 后，對軟骨球進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，進(jìn)行番紅O 染色;RT-qPCR 檢測成軟骨分化相關(guān)基因:ACAN;成骨分化相關(guān)基因: OSX; 成脂分化相關(guān)基因: PPARG 的表達(dá)，選取誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞，用Trizol 法提取細(xì)胞RNA。RNA 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR 檢測。對照組為無誘導(dǎo)分化能力的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。引物由上海捷瑞生物科技公司負(fù)責(zé)合成（引物序列見表1）。

表1 引物名稱、引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測人源跟腱干細(xì)胞Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Collagen Ⅲ、Tenascin-C、Scleraxis 的表達(dá)

取P3 代細(xì)胞，消化后接種于24 孔板，待細(xì)胞融合達(dá)到50%時，吸棄完全培養(yǎng)基，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton X-100（PBS 配制）室溫通透20 min。一抗4℃孵育過夜，PBS 清洗3 次，加入熒光標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，PBS 清洗后進(jìn)行DAPI 染核，用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集照片。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析和成組 檢驗進(jìn)行分析；計數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗進(jìn)行組間比較。＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)、增殖能力的觀察

P0 代細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)第5 天，細(xì)胞融合率達(dá)到約70%，細(xì)胞形態(tài)呈多邊形或星型（見圖1A），繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合率更高時，細(xì)胞呈現(xiàn)特征性的“鵝卵石樣”排列（見圖1B）。繼續(xù)傳代至P3 代，細(xì)胞呈扁平狀或成纖維細(xì)胞狀（見圖1C）。

CCK-8 法測定細(xì)胞增殖實驗證實: 同一代的hTDSCs 的OD 值隨培養(yǎng)時間的延長而升高，培養(yǎng)1、3、5、7 d 時，P1、P2、P3 代細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），如圖2 所示。

圖2 CCK-8 檢測P1、P2、P3 代TDSC 細(xì)胞增殖能力差異

2.2 細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定

本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)來分析hTDSCs細(xì)胞的表面標(biāo)志物。結(jié)果 顯示：CD34 (-) CD44 (+) CD45 (-) CD90 (+)。CD34 (-) CD45 (-)，排除了造血細(xì)胞和上皮細(xì)胞污染的可能性，干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44、CD90 均為強(qiáng)陽性，CD44陽性率為95.79%，CD90 陽性率為99.61%。初步證明分離細(xì)胞是具有干性的，如圖3 所示。

2.3 細(xì)胞多向分化潛能的鑒定

成骨誘導(dǎo)分化：P3 代hTDSCs/hBMSCs 在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21 d 后，用茜素紅進(jìn)行染色。兩種細(xì)胞均呈層疊樣生長，并且出現(xiàn)明顯的聚集，局部出現(xiàn)鈣鹽沉積，形成鈣結(jié)節(jié)，茜紅素染色出現(xiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)，證明hTDSCs 與hBMSCs 一樣，具有成骨分化能力（見圖4D）。RT-qPCR 結(jié)果顯示hTDSCs 表達(dá)成骨分化相關(guān)基因：OSX 的表達(dá)較空白對照組明顯增加（見圖4G）。

成脂誘導(dǎo)分化：P3 代hTDSCs 通過成脂肪誘導(dǎo)分化28 d后，細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)脂肪滴，并逐漸增大、融合。油紅O 染色后可見細(xì)胞內(nèi)大小不等的橘紅色脂滴（見圖4E）。P3 代hTDSCs 分化結(jié)果的陽性染色區(qū)域與hBMSCs 基本一致。PPARG 的表達(dá)較對照組升高約4 倍（見圖4H），證明hTDSCs有明顯成脂分化能力。

成軟骨誘導(dǎo)分化:兩種細(xì)胞微球在軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中立體培養(yǎng)21 d 后，細(xì)胞微球福爾馬林固定、石蠟切片、番紅O 染色后光鏡下觀察，細(xì)胞微團(tuán)被染成紅色，證明有軟骨生成（見圖4F）。成軟骨相關(guān)基因ACNA 的表達(dá)水平也明顯升高（見圖4I），證明hTDSCs 有明顯成軟骨分化能力。

2.4 細(xì)胞表達(dá)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Collagen Ⅲ、Tenascin-C、Scleraxis 的研究

細(xì)胞免疫熒光顯示，hTDSCs 表達(dá)Collagen Ⅰ（見圖5A）、Collagen Ⅲ（見圖5C）、Scleraxis（見圖5D）、Tenascin-C（見圖5E），不表達(dá)Collagen Ⅱ（見圖5B）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，從左到右分別為CD34、CD44、CD45、CD90，其中CD44、CD90 為強(qiáng)陽性。CD34、CD45 為陰性，下排為同型對照，均為陰性

圖4 A-C.分別為P3 代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂肪、成軟骨分化結(jié)果（×200）; D-F.分別為P3 代跟腱干細(xì)胞成骨、成脂肪、成軟骨分化結(jié)果（×200）;G-I.為RT-qPCR 檢測成骨分化相關(guān)基因（OSX）、成脂分化相關(guān)基因（PPARG）、成軟骨分化相關(guān)基因（ACAN）在空白對照組和分化組的表達(dá)水平。*表示≤0.05;***表示≤0.001

圖5 共聚焦顯微鏡拍攝細(xì)胞免疫熒光結(jié)果（×400）

3 討論

跟腱是一種致密、規(guī)則的結(jié)締組織，主要由Ⅰ型膠原組成。膠原纖維平行排列，組成被腱內(nèi)膜包裹的跟腱束，跟腱束致密地平行排列，形成跟腱[8]。跟腱損傷是運(yùn)動員的常見疾病之一，由于肌腱的再生能力比較差，跟腱斷裂后常常由錯亂排列的瘢痕組織修復(fù)，其生物力學(xué)強(qiáng)度很難再滿足劇烈運(yùn)動的要求。近些年，組織工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，為跟腱損傷的治療提供了新的思路。干細(xì)胞治療跟腱損傷具有非常廣闊的應(yīng)用前景。2007 年，Bi 等[9]從小鼠和成人的跟腱組織中分離出干細(xì)胞，并且將其命名為跟腱干細(xì)胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）。Yang 等[1]在2016 年對胎牛的跟腱細(xì)胞進(jìn)行處理，分離出牛跟腱干細(xì)胞，為跟腱干細(xì)胞治療肌腱損傷提供理論支持和實驗室依據(jù)。跟腱干細(xì)胞可以自然地朝跟腱細(xì)胞分化[10]，因此跟腱干細(xì)胞在治療跟腱損傷上具有無可比擬的優(yōu)勢。

跟腱干細(xì)胞能夠廣泛應(yīng)用于臨床的基礎(chǔ)之一就是能夠更高效地分離、培養(yǎng)這種細(xì)胞，因此探索一種高效的分離辦法迫在眉睫。本實驗采用先用胰蛋白酶預(yù)消化，然后用Ⅰ型膠原酶和中性蛋白酶混合消化的分次消化辦法成功分離出大量跟腱干細(xì)胞。本實驗分離的細(xì)胞從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)志物、多向分化潛能3 個方面鑒定了其干細(xì)胞特性。跟腱干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34-、CD44+、CD45-、CD90+，這其中CD34-、CD45-排除了細(xì)胞干性來源于血液干細(xì)胞的可能性，這與目前已有的大鼠和牛來源的跟腱干細(xì)胞研究是吻合的[1,11-13]。跟腱干細(xì)胞具有朝骨、軟骨、脂肪分化的潛能，這可以解釋一些肌腱疾病的病因。目前有學(xué)者認(rèn)為，跟腱干細(xì)胞在病理狀態(tài)下的異常分化可能是肌腱慢性疾病的發(fā)病原因[14]，而目前常見的肌腱損害的主要病理特征為鈣質(zhì)沉積、脂肪變性[15]，這與跟腱干細(xì)胞在病理狀態(tài)下生長分化的結(jié)果是一致的。通過細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)：人源跟腱干細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白，不表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白，這與跟腱組織中的主要膠原蛋白類型是吻合的[16]。通過免疫組化可知，跟腱組織中，約95%為Ⅰ型膠原纖維，約5%為Ⅲ型膠原纖維。Ⅰ型膠原纖維是成熟的膠原類型，而Ⅲ型膠原纖維主要起修復(fù)作用，在跟腱損傷的早期，Ⅲ型膠原表達(dá)量上調(diào)。在跟腱損傷疤痕愈合后，這兩種膠原表達(dá)量均明顯下降[17]。這提示我們：跟腱干細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白，很有可能是跟腱干細(xì)胞促進(jìn)跟腱損傷愈合的機(jī)制之一。同時，人源跟腱干細(xì)胞表達(dá)Tenascin-C、Scleraxis 蛋白。Tenascin-C 是一種黏附調(diào)節(jié)蛋白，它在發(fā)育、分化或傷口愈合期間調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[18]。說明跟腱干細(xì)胞在跟腱損傷時，能夠調(diào)節(jié)自身增殖分化為跟腱細(xì)胞，從而加速損傷的愈合。有研究表明，Scleraxis 可將其他來源干細(xì)胞分化為肌腱細(xì)胞[19]，這說明Scleraxis 在調(diào)節(jié)祖細(xì)胞分化為肌腱組織及肌肉附著物中起重要作用[20]。肌腱干細(xì)胞表達(dá)這些蛋白，都說明其在跟腱組織的發(fā)育分化以及損傷修復(fù)中起重要作用。然而，跟腱干細(xì)胞在體內(nèi)的確切作用機(jī)制還不清楚，它可能通過直接分化為終末細(xì)胞或分泌有利于肌腱修復(fù)的營養(yǎng)因子來維持肌腱的穩(wěn)態(tài)和加速肌腱的修復(fù)[21-22]。如果能研究清楚其確切作用機(jī)制，那么在未來的細(xì)胞藥物或生物材料領(lǐng)域可能會起到一定作用。目前已有研究者將其作為種子細(xì)胞應(yīng)用于動物跟腱損傷模型的研究[23]。近年來，國內(nèi)外有大量文獻(xiàn)研究復(fù)合支架材料搭載干細(xì)胞用于治療[24-25]。并且取得了比單純搭載支架或單純細(xì)胞移植更好的預(yù)后。這說明，人源跟腱干細(xì)胞也可能是一種可以搭載在生物材料上的種子細(xì)胞，通過其釋放的細(xì)胞外基質(zhì)，起到加速損傷愈合，從而使損傷的肌腱獲得更接近生理狀態(tài)下的肌纖維結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)特性。

綜上所述，酶消化法是分離、培養(yǎng)跟腱干細(xì)胞的有效辦法，跟腱干細(xì)胞表達(dá)與跟腱損傷修復(fù)密切相關(guān)的蛋白。本實驗為跟腱干細(xì)胞細(xì)胞系的建立及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。