破骨細(xì)胞融合分子機(jī)制的研究進(jìn)展*

楊文杰 李耀璽 段莉 王大平*

[關(guān)鍵字] 破骨細(xì)胞；細(xì)胞融合；分子機(jī)制

破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）是一類由骨髓造血干細(xì)胞來源的單核/巨噬前體細(xì)胞融合分化而來的多核巨細(xì)胞（含有3 ～100 個細(xì)胞核，細(xì)胞直徑可達(dá)100 m），是體內(nèi)介導(dǎo)骨吸收的主要細(xì)胞。破骨細(xì)胞體積越大，其所含的骨降解相關(guān)酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶9、組織蛋白酶K 等）就越多，其骨吸收能力也越強(qiáng)，所以破骨細(xì)胞體積大小是評估或衡量衡量破骨細(xì)胞骨吸收能力的重要指標(biāo)。破骨細(xì)胞的體積與破骨細(xì)胞核的數(shù)量成正相關(guān)[1]。研究表明，單核細(xì)胞與單核細(xì)胞、單核細(xì)胞與多核破骨細(xì)胞以及多核破骨細(xì)胞之間均可相互融合，其中以單核細(xì)胞與多核破骨細(xì)胞融合為主，以形成破骨細(xì)胞或細(xì)胞核數(shù)目更多的破骨細(xì)胞，所以細(xì)胞間融合是生成破骨細(xì)胞的關(guān)鍵[2]。隨著近年來對破骨細(xì)胞相關(guān)研究的不斷推進(jìn)，人們對破骨細(xì)胞融合分子機(jī)制的認(rèn)識也不斷加深，這為治療破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)所致的骨破壞過多疾?。ㄈ绻琴|(zhì)疏松、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等）尋求新的突破點(diǎn)。

正常情況下，細(xì)胞的脂質(zhì)雙分子層之間通過疏水作用、靜電斥力和膜蛋白質(zhì)的空間相互作用使自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定下來。破骨細(xì)胞前體細(xì)胞被招募、遷移到骨表面時，各細(xì)胞生物膜之間的初始距離較大（＞20 nm），融合蛋白必須使預(yù)融合細(xì)胞間的脂質(zhì)雙層局部彎曲，使最強(qiáng)的膜間排斥面積最小化，從而使預(yù)融合細(xì)胞間緊密接觸（幾納米的距離），下游的融合事件才得以進(jìn)行[3]。細(xì)胞融合過程可歸納如下：首先，細(xì)胞識別其融合伴侶細(xì)胞，然后細(xì)胞質(zhì)膜中的磷脂雙層相互接觸形成半融合結(jié)構(gòu)，隨后半融合結(jié)構(gòu)進(jìn)一步形成融合孔，最后融合孔擴(kuò)張、細(xì)胞內(nèi)容物混合完成細(xì)胞融合[4-5]。

1 細(xì)胞識別

細(xì)胞識別（cell recognition）是指細(xì)胞通過其表面的分子選擇性地和其他細(xì)胞表面分子結(jié)合的現(xiàn)象。這些表面分子主要是蛋白質(zhì)和糖蛋白。研究表明，發(fā)生融合的破骨細(xì)胞前體（即破骨細(xì)胞融合伴侶，osteoclast fusion partners）間存在互補(bǔ)分子的差異，融合前融合伴侶間存在選擇性，故破骨細(xì)胞融合伴侶間存在細(xì)胞間的相互識別[6]。

抑制或敲除CD47 可分別抑制鼠OCs 以及巨噬細(xì)胞的融合[7]。Frendo 等[8]在Syncytin-1 反義RNA 存在或不存在情況下研究人類滋養(yǎng)層細(xì)胞融合時對所得細(xì)胞的核數(shù)量進(jìn)行終點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)3 ～5 個核的合胞體的比例明顯增加，而6 個核以上合胞體的比例顯著降低。M?ller 等[7]在研究破骨細(xì)胞融合不同階段中CD47 和Syncytin-1 的參與情況，共分析了1 808 個破骨細(xì)胞前體個體融合事件，發(fā)現(xiàn)CD47 和Syncytin-1 在破骨細(xì)胞融合中具有不同的作用，其作用取決于融合伴侶的核數(shù)目。CD47 促進(jìn)單核破骨細(xì)胞前體間融合，Syncytin-1 可促進(jìn)2 個多核破骨細(xì)胞間的融合。因此，CD47和Syncytin-1 可能介導(dǎo)破骨細(xì)胞前體間的識別。此外，破骨細(xì)胞融合伴侶間融合主要通過2 種不同類型的細(xì)胞接觸進(jìn)行：吞噬杯狀結(jié)構(gòu)和寬接觸表面。CD47 主要通過融合伴侶細(xì)胞膜間的寬接觸表面來介導(dǎo)融合，而Syncytin-1 則通過吞噬杯狀結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)融合。

破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表達(dá)的CD47（又稱整聯(lián)蛋白相關(guān)蛋白）和信號調(diào)節(jié)蛋白（SIRP- ）都是Ig 超家族的成員，其中CD47 可以作為SIRP- 的配體。CD47-SIRP 相互作用可抑制巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞融合形成破骨細(xì)胞[9]。

破骨細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白（DC-STAMP）是一種多次跨膜蛋白，是主導(dǎo)破骨細(xì)胞前體融合的主要蛋白質(zhì)，是OC 融合的關(guān)鍵因素之一，其主要在單核破骨細(xì)胞前體的質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)[10]。RANKL 可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體表達(dá)DCSTAMP，在破骨細(xì)胞形成過程中DC-STAMP 的表達(dá)是逐漸降低的[11]。Mensah 等[10]研究DC-STAMP 在巨噬細(xì)胞和RAW264.6 巨噬細(xì)胞細(xì)胞系的融合中發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞在用RANKL處理后可引起大約一半細(xì)胞細(xì)胞膜上的DC-STAMP轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，然后根據(jù)巨噬細(xì)胞和RAW264.6 巨噬細(xì)胞系細(xì)胞膜上DC-STAMP 含量分成DC-STAMPhi和DC-STAMPLo兩個群體。當(dāng)一個融合伴侶細(xì)胞膜上的DC-STAMPhi，另一個為DC-STAMPlo時，破骨細(xì)胞間才能有效融合[10,12]。S?e 等[2]在研究人類656 個破骨細(xì)胞的融合事件中發(fā)現(xiàn)人類破骨細(xì)胞前體（preOCs）和破骨細(xì)胞（OCs）在選擇合適融合伴侶時的特征:融合伴侶通常包括一個不移動的融合受體細(xì)胞和一個可移動融合供體細(xì)胞; 不移動細(xì)胞主要是多核的，并且主要通過與含有一個細(xì)胞核的可移動細(xì)胞融合來增加它們的核數(shù)目; 較成熟的preOC / OC 趨向于和較不成熟的preOC 融合。RANKL 刺激preOC/OC 可誘導(dǎo)DC-STAMP-配體（該配體尚未被鑒定出來，可能是可溶性的或者是與膜結(jié)合的）的表達(dá)，隨后DC-STAMP-配體通過自分泌和（或）通過G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的旁分泌來誘導(dǎo)融合基因表達(dá)[13]。因此推斷DC-STAMP 可能參與破骨細(xì)胞前體間某些起識別（如CD47、Syncytin-1 等）或融合作用分子表達(dá)的調(diào)控。

2 融合中間結(jié)構(gòu)的形成

當(dāng)兩個preOC / OC 相互識別后，細(xì)胞即將進(jìn)入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層融合階段（見圖1 A），當(dāng)然這需要某些特定融合蛋白的存在。對無蛋白質(zhì)的脂質(zhì)膜融合過程的研究中發(fā)現(xiàn)存在2 種重要的中間結(jié)構(gòu)：半融合結(jié)構(gòu)和融合孔[4]。其中半融合結(jié)構(gòu)是形成融合孔的中間體[14]。

半融合結(jié)構(gòu)表示相互黏附脂質(zhì)雙層間的外層小葉之間有聯(lián)系，而內(nèi)層小葉仍保持不變（見圖1C）[4]。蛋白質(zhì)通過誘導(dǎo)膜接觸處的局部脫水和控制膜的彈性應(yīng)力來促進(jìn)半融合結(jié)構(gòu)的形成。半融合結(jié)構(gòu)是一種瞬時結(jié)構(gòu)，它可解離形成2 個分離的（脂質(zhì)雙層）細(xì)胞，也可進(jìn)一步融合形成融合孔[15-16]。

Chernomordik 等[3]對生物重塑表征良好的流感血凝素介導(dǎo)的融合現(xiàn)象和機(jī)制與無蛋白的脂質(zhì)雙層融合進(jìn)行比較，認(rèn)為脂質(zhì)雙層發(fā)生半融合和形成融合孔的傾向主要取決于脂質(zhì)雙層中脂質(zhì)的組成。脂質(zhì)雙層中特定的脂質(zhì)分子通過其分子結(jié)構(gòu)和單層內(nèi)的脂質(zhì)相互作用形成有效的自發(fā)曲率，從而影響不同融合中間結(jié)構(gòu)的形成。磷脂酰乙醇胺（PE）的脂質(zhì)傾向于形成負(fù)自發(fā)曲率（呈錐形）（見圖2A），磷脂酰膽堿的脂質(zhì)傾向于形成略微負(fù)曲率，其自發(fā)曲率接近于零（近似圓柱形）（見圖2B），溶血磷脂酰膽堿（LPC）傾向于形成正自發(fā)曲率（呈倒錐形）（見圖2C）。當(dāng)把倒錐形的LPC和錐形的PE 添加到接觸小葉中時，可分別抑制和促進(jìn)半融合，這表明半融合結(jié)構(gòu)的形成與凈負(fù)曲率相關(guān)；當(dāng)把LPC和PE 添加到接觸小葉外（即膜的非接觸處）可分別促進(jìn)和抑制融合孔形成，表明融合孔形成與非接觸小葉的凈正曲率相關(guān)[4]。說明半融合結(jié)構(gòu)形成后，預(yù)融合的脂質(zhì)雙層在接觸處要形成較大的凈負(fù)曲率，而在非接觸處則需形成較大的凈正曲率，半融合結(jié)構(gòu)才能進(jìn)一步形成融合孔。

在生物物理學(xué)上，PE 的頭基較少與水結(jié)合，使得相鄰的富含PE 的脂質(zhì)雙層可以容易地彼此相互作用[5]。Kreutzberger 等[17]在對細(xì)胞胞吐過程的研究中指出PE 可促進(jìn)膜變形和穩(wěn)定融合孔。Irie 等[5]在通過定量PCR 和shRNA 介導(dǎo)基因敲除的方法研究破骨細(xì)胞形成過程中磷脂的動力學(xué)，首次證明了PE 在質(zhì)膜中的重新分布（從脂質(zhì)雙層的內(nèi)層小葉轉(zhuǎn)移至外層小葉）是破骨細(xì)胞融合所必需的，其中ABCB4和ABCG1 負(fù)責(zé)PE 的重新分布。將單核細(xì)胞表面PE 固定，可使其不能融合形成多核破骨細(xì)胞[5,18]。在融合過程中融合蛋白的主要作用是產(chǎn)生和控制膜彈性應(yīng)力[3]。融合蛋白引發(fā)脂質(zhì)重排的關(guān)鍵步驟是將膜雙層局部彎曲成指向即將與其融合的伴侶細(xì)胞的乳頭狀突起（見圖1B）；并且融合蛋白可通過降低半融合結(jié)構(gòu)形成和融合孔開放的能障使乳頭狀突起的頂部融合[4,19]。所以，推測將破骨細(xì)胞前體質(zhì)膜中PE 固定或抑制PE 在質(zhì)膜中的再分配使破骨細(xì)胞前體不能形成多核破骨細(xì)胞原因可以解釋為:即使融合蛋白使2 個破骨細(xì)胞前體間密切接觸，但由于質(zhì)膜外層小葉中無足夠的PE，使得細(xì)胞前體間的相互作用力不足，致使二者不能進(jìn)行融合;在破骨細(xì)胞前體間的接觸小葉處不能形成有效的或足夠大的負(fù)性曲率，從而抑制破骨細(xì)胞前體由半融合結(jié)構(gòu)向融合孔方向發(fā)展。

融合孔是發(fā)生融合的2 個脂質(zhì)雙層膜間內(nèi)、外層小葉之間的連接，它的形成在細(xì)胞間建立了水性連接（見圖1D）。融合孔形成后相互融合的前體細(xì)胞間有內(nèi)層小葉脂質(zhì)和水內(nèi)容物的混合[16,20]。融合孔的結(jié)構(gòu)是由融合蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）圍成的完全蛋白質(zhì)通道樣結(jié)構(gòu)，且其外層可能被脂質(zhì)覆蓋，從而在膜的接觸小葉之間形成脂質(zhì)連接[21]。

圖1 兩細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層間的融合是通過半融合途徑進(jìn)行的（A→B→C→D）為兩個細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的融合順序）。A.2 個預(yù)融合細(xì)胞間在促融合劑作用下或相互識別后，逐步相互靠近或接觸;B.2個預(yù)融合細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層局部彎曲成乳頭狀突起;C.半融合結(jié)構(gòu)形成:2 個細(xì)胞膜（脂質(zhì)雙分子層）呈乳頭狀突起，脂質(zhì)雙分子層中的外層小葉相互接觸混合，而內(nèi)層小葉仍各自保持獨(dú)立; D.融合孔形成: 2 個細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的內(nèi)外層小葉以及2 個細(xì)胞的胞漿相互混合

圖2 不同的脂質(zhì)分子可自發(fā)地形成不同的曲率的單層，從而表現(xiàn)為不同的子形狀: A.磷脂酰乙醇胺（PE）可形成的錐形單層（單層向烴鏈的方向上膨脹）;B.磷脂酰膽堿（PC）可形成幾乎平坦的單層;C.溶血磷脂酰膽堿（LPC）可形成倒錐形的單層（單層向極性頭的方向上膨脹）

ATP門控P2X7 受體是屬于P2X嘌呤能受體家族的質(zhì)膜受體，由造血起源的細(xì)胞表達(dá)，其活化后主要通過改變細(xì)胞膜對離子的通透性，從而觸發(fā)多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)事件，如細(xì)胞因子釋放、炎癥、免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡[22-23]。另外，有研究表明P2X7 受體參與多核巨細(xì)胞和細(xì)胞多核化的產(chǎn)生[24]。在體內(nèi)、外人破骨細(xì)胞均可表達(dá)P2X7 受體，且P2X7 受體具有明顯的成孔作用，用拮抗劑氧化ATP、用單克隆抗體阻斷P2X7 受體或抑制P2X7 受體基因表達(dá)均可顯著抑制破骨細(xì)胞前體間的融合，所以P2X7 受體可能參與破骨細(xì)胞間融合孔的形成[24]。

脂筏（lipid-raft）是位于質(zhì)膜的外層小葉中由脂質(zhì)—脂質(zhì)（膽固醇，鞘脂和飽和脂肪酸[25-26]）和脂質(zhì)—蛋白質(zhì)[27]（膜—肌動蛋白細(xì)胞骨架）相互作用形成的動態(tài)結(jié)構(gòu)域，大小約70 nm。stomatin 是脂筏的主要成分之一，在許多細(xì)胞類型中廣泛表達(dá)（存在于質(zhì)膜和外泌體中），具有疏水結(jié)構(gòu)域、棕櫚酰化和寡聚化等特殊結(jié)構(gòu)，其可通過分子間相互作用來調(diào)節(jié)膜受體，并誘導(dǎo)不同類型的細(xì)胞融合形成多核細(xì)胞[28-29]。當(dāng)外泌體與靶細(xì)胞膜融合或者以胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞后，stomatin 可在脂筏內(nèi)形成高級寡聚體并執(zhí)行其功能。stomatin可通過共聚效應(yīng)促進(jìn)促融合蛋白之間的相互作用，也可通過增加質(zhì)膜滲透性來緩解膜彎曲應(yīng)力，導(dǎo)致促融合分子聚集到肌動蛋白細(xì)胞骨架上，從而作為剛性支撐平臺或肌動蛋白聚合位點(diǎn)以驅(qū)動融合孔的擴(kuò)張；在破骨細(xì)胞形成過程中，stomatin 的增加可促進(jìn)preOC 融合，stomatin 的減少抑制preOC 融合[30]。

3 展望

破骨細(xì)胞融合過程包括識別、融合中間結(jié)構(gòu)和融合孔的形成。破骨細(xì)胞前體間的融合與破骨細(xì)胞大小及其骨吸收能力密切相關(guān)，故對其融合進(jìn)行調(diào)控有望成為治療骨吸收亢進(jìn)性疾病的突破點(diǎn)。目前，已確定與融合中間結(jié)構(gòu)形成有關(guān)的分子包括ABCB4、ABCG1、P2X7 受體等，然而，這些分子并非是preOC /OC 特異表達(dá)，如單用某種藥物來長期抑制破骨細(xì)胞的形成可導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，深入研究破骨細(xì)胞特異性融合蛋白（或分子），可為研發(fā)治療骨吸收亢進(jìn)性疾病的特異性藥物奠定基礎(chǔ)。