酶法制備花生源鋅螯合肽工藝

李晨，布冠好，陳復(fù)生

河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院（鄭州 450001）

鋅是重要的微量元素，其含量僅次于鐵。鋅參與并組成人體內(nèi)數(shù)百種功能蛋白和酶，人體的成長發(fā)育及免疫功能和脂類代謝等生命活動都離不開鋅的作用。自然界中的鋅來源廣泛，十分充足，但人體對鋅元素的吸收代謝卻受到限制，致使人體無法攝入足夠的鋅。市面上一些補(bǔ)鋅產(chǎn)品大多是無機(jī)鹽添加劑類，如硫酸鋅，由于這些產(chǎn)品不穩(wěn)定，對胃腸道造成刺激[1]，所以不適合長期攝入。研究顯示低分子量的可溶性有機(jī)化合物，如有機(jī)酸、氨基酸和多肽，在與鋅離子螯合后，可以提高鋅的生物利用度[2]。利用許多食物蛋白可以制備鋅螯合肽，如芝麻蛋白[3]、乳蛋白[4]、牦牛酪蛋白[5]和牡蠣蛋白[6]。相較于無機(jī)鋅鹽，肽鋅螯合物中的鋅能被胃腸更好吸收[7]。

花生蛋白是一種優(yōu)良的可食用性蛋白質(zhì)，在植物蛋白中，其在營養(yǎng)方面和數(shù)量上僅次于大豆蛋白?；ㄉ鞍踪|(zhì)中90%是花生球蛋白和伴花生球蛋白，清蛋白占10%左右。它富含多種礦物質(zhì)、微量元素、維生素及氨基酸，且易被人體消化吸收，有效利用率98%。中國花生產(chǎn)量巨大，榨油后的花生粕常作為飼料或直接作肥料用，致使花生蛋白并未得到充分利用，研究以花生粕作為金屬螯合肽制備的蛋白質(zhì)來源，具有一定意義。試驗通過酶解花生蛋白，以花生蛋白水解物的鋅螯合率為指標(biāo)，從3種蛋白酶中篩選出制備金屬螯合肽的適宜用酶，并優(yōu)化蛋白酶酶促水解花生蛋白的工藝條件。由傳統(tǒng)的花生蛋白領(lǐng)域向功能性花生肽領(lǐng)域拓展，為花生肽的金屬螯合作用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生（遠(yuǎn)雜9102，河南省農(nóng)科院）；堿性蛋白酶（1.8×105U/mL）、胰蛋白酶（2.4×105U/g，諾維信公司）；木瓜蛋白酶（80×104U/g，上海源葉有限公司）；硫酸鋅（分析純，天津市科密歐公司）；無水乙醇（分析純，天津市天力公司）；硝酸（分析純，洛陽市昊華公司）；高氯酸（分析純，天津市鑫源公司）；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

GL-10000 C高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3 C酸度計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；SQP電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；LGJ-18型冷凍干燥機(jī)（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠）；UV-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；JJ-6六聯(lián)電動攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）；傅里葉變換紅外光譜（北京瑞麗分析儀器有限公司）；ICE 3000火焰原子吸收光譜（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生蛋白的制備

精選花生仁→低溫烘干→脫紅衣→脫衣花生仁→低溫冷榨→低溫冷榨餅→粉碎→低溫脫脂→過篩→脫脂花生粕粉→去離子水（1∶10，g/mL）→1 mol/L NaOH溶液→調(diào)節(jié)pH 9.0→水浴攪拌（50 ℃）2 h→4 000 r/min下離心10 min→收集上清液→1 mol/L HCl溶液→調(diào)節(jié)pH 4.5→水浴攪拌（45 ℃）30 min→4 000 r/min下離心10 min→棄去上清液→收集沉淀→真空冷凍干燥→花生蛋白。

1.3.2 酶法制備花生肽

取一定量1.3.1制備的花生蛋白，加入適量去離子水，于90 ℃下攪拌預(yù)熱10 min，冷卻后，將燒杯置于恒溫水浴鍋中并控溫加酶，不斷攪拌下，使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液保持體系pH不變，反應(yīng)結(jié)束后，在沸水中加熱10 min滅酶，冷卻后，以4 000 r/min離心20 min，過濾，收集上清液并凍干，得到花生肽粉末[8]。

1.3.3 酶解產(chǎn)物水解度的測定

通過茚三酮比色法測定水解度[9]。

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

甘氨酸在105 ℃條件下干燥3 h，配制成質(zhì)量濃度分別為100，125，150，175，200和225 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1.0 mL甘氨酸溶液，加入1.0 mL 0.2 mol/L pH 8.04的磷酸鹽緩沖溶液，加入1.0 mL的茚三酮顯色劑，于90 ℃水浴鍋中加熱15 min，置于冷水中5 min，加水稀釋至25 mL，于570 nm波長下測定吸光度。

1.3.3.2 酶解樣品水解度的測定

將酶解樣品稀釋一定倍數(shù)后，以4 000 r/min離心15 min，取1.0 mL上清液，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液和1.0 mL茚三酮顯色劑，后續(xù)步驟同1.3.3.1?；ㄉ蛛x蛋白的上清液在相同條件下用作空白對照。

1.3.3.3 水解度（DH）計算

式中：N1為酶解樣品的游離氮含量，mol/L；N0為花生分離蛋白原料的游離氮含量，mol/L；N總為樣品總氮含量，mol/L。N1和N0根據(jù)甘氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相對分子質(zhì)量計算；N總根據(jù)樣品的蛋白含量計算。

1.3.4 花生肽鋅螯合物的制備

取一定量1.3.2制得的凍干后的花生肽粉[10]，用去離子水配置為10 mg/mL的肽溶液，按體積比2∶1加入10 mg/mL的ZnSO4溶液，調(diào)節(jié)體系至pH 5.0，在60 ℃下充分?jǐn)嚢? h。

1.3.5 鋅離子螯合率的測定

鋅離子螯合率的測定采用原子吸收法（AAS）。

總鋅含量測定時樣品的處理方法：取1.3.4反應(yīng)液5 mL，用去離子水定容至50 mL。

螯合肽鋅含量的測定時樣品的處理方法：另取1.3.4反應(yīng)液5 mL，以5 000 r/min離心10 min除去雜質(zhì)，上清液加入3倍體積的無水乙醇，充分混合均勻后以3 500 r/min離心15 min，棄去上清液，將沉淀用去離子水定容至50 mL。

鋅螯合率的計算方法如式（2）。

1.3.6 最佳水解酶的選擇

選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶3種酶酶解花生蛋白，反應(yīng)體系的底物濃度5%，加酶量5 000 U/g，酶解溫度和pH分別為各酶的最適條件，水解不同時間（1，2，3，4和5 h）后獲得水解產(chǎn)物，酶解過程同1.3.2，凍干，進(jìn)行螯合反應(yīng)，螯合過程同1.3.4，按照式（2）計算螯合率。各蛋白酶的最適酶解溫度和pH如表1所示，考察水解時間與鋅離子螯合率的關(guān)系。以鋅離子螯合率為指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。

表1 酶解最適pH及溫度

1.3.7 單因素試驗

篩選出最佳酶后，對酶解條件的4個因素（底物濃度、酶解時間、酶解pH、酶解溫度）進(jìn)行單因素優(yōu)化，考察單一因素對反應(yīng)的水解度（DH）及螯合率的影響。

1.3.7.1 底物濃度對水解度及螯合率的影響

配制底物濃度分別為1%，3%，5%，7%和9%的花生分離蛋白溶液，酶解時加酶量5 000 U/g、pH 6.5、溫度45 ℃、時間4 h，酶解過程同1.3.2，螯合過程同1.3.4，酶解之后測定花生分離蛋白酶解液的水解度和鋅螯合率。

1.3.7.2 pH對DH及螯合率的影響

配制底物濃度5%的花生分離蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、酶解溫度45 ℃、時間4 h，控制酶解時的pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5和8.0，酶解過程同1.3.2，螯合過程同1.3.4，酶解之后測定花生分離蛋白酶解液的水解度和鋅螯合率。

1.3.7.3 酶解溫度對DH及螯合率的影響

配制底物濃度5%的花生分離蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、pH 6.5、時間4 h，控制酶解溫度分別為40，45，50，55和60 ℃，酶解過程同1.3.2，螯合過程同1.3.4，酶解之后測定花生分離蛋白酶解液的水解度和鋅螯合率。

1.3.7.4 酶解時間對DH及螯合率的影響

配制底物濃度為5%的花生分離蛋白溶液，加酶量5 000 U/g、pH 6.5、酶解溫度45 ℃，控制酶解時間分別為1，2，3，4和5 h，酶解過程同1.3.2，螯合過程同1.3.4，酶解之后測定花生分離蛋白酶解液的水解度和鋅螯合率。

1.3.8 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交法對酶解蛋白工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以螯合率為指標(biāo)，采用四因素三水平的正交分析法設(shè)計試驗。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗中所有數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

圖1～圖3分別表示堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶對花生蛋白酶解物的水解度及其鋅螯合率的影響。

由圖1～圖3可知，3種酶作用的水解液都具有螯合能力。隨著水解時間變化，3種酶解液的水解度都逐漸上升后下降或趨于穩(wěn)定，螯合率也隨著時間延長而升高，堿性蛋白酶在其酶解3 h時，螯合率達(dá)到最高為44.77%；木瓜蛋白酶在其酶解3 h時，螯合率達(dá)到最高為45.14%；胰蛋白酶在其酶解2 h時，螯合率達(dá)到最高為49.81%。即胰蛋白酶水解物的鋅螯合率明顯高于堿性蛋白酶水解物和木瓜蛋白酶水解物，這是因為3種酶的酶解反應(yīng)條件不同，且各酶都具有專一性，不同的酶切位點導(dǎo)致產(chǎn)物肽的C末端、N末端的氨基酸組成及排列各不相同，進(jìn)而導(dǎo)致肽段的活性有所不同[11]，使得花生肽的金屬螯合能力有強(qiáng)弱差別。綜合分析，在較短時間內(nèi)，胰蛋白酶水解物的鋅螯合率較高，因此選擇胰蛋白酶為最佳水解酶。

圖1 堿性蛋白酶對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

圖2 木瓜蛋白酶對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

圖3 胰蛋白酶對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

2.2 單因素試驗

2.2.1 底物濃度對DH及螯合率的影響

圖4表示在不同底物濃度條件下，花生蛋白酶解液的水解度與肽鋅螯合率的變化。

在不同底物濃度條件下，花生蛋白酶解液的水解度與肽鋅螯合率的變化如圖4所示。在反應(yīng)初始階段，水解度和螯合率都隨著底物濃度的升高而處于上升狀態(tài)，底物濃度5%時，DH和螯合率達(dá)到最大值，螯合率為48.62%；底物濃度大于5%后，DH和螯合率都呈現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是底物濃度1%時，水解度較低，同時造成肽段數(shù)量減少，螯合率較低，增加底物濃度后，花生蛋白分散均勻，與蛋白酶接觸更充分，有利于水解反應(yīng)的發(fā)生，與鋅離子配位的肽段數(shù)量增加，從而螯合率上升[12]；底物濃度過大，蛋白酶分子的擴(kuò)散受到抑制，進(jìn)而影響水解度和螯合率。結(jié)合生產(chǎn)成本，選擇底物濃度5%為最優(yōu)酶解條件。

圖4 底物濃度對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

2.2.2 pH對DH及螯合率的影響

圖5表示在不同pH條件下，花生蛋白酶解液的水解度與肽鋅螯合率的變化。

pH會影響蛋白酶的活力，從而影響水解效果[13]。由圖5可知，pH 6～8，水解度先上升后趨于平緩；隨著pH增加，螯合率先上升后下降，pH 6.5時螯合率達(dá)到最大為48.01%。這可能與胰蛋白酶的最適pH有關(guān)，反應(yīng)體系pH過高或過低時都會導(dǎo)致酶的生物活性降低，造成水解度變化，而螯合率與水解度具有一定關(guān)系，因此確定pH 6.5為最優(yōu)條件。

圖5 pH對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

2.2.3 酶解溫度對DH及螯合率的影響

圖6所示在不同酶解溫度條件下，花生蛋白酶解液的水解度與肽鋅螯合率的變化。

DH和螯合率隨溫度變化趨勢明顯，酶解溫度40～60 ℃時，水解度成波動變化，但螯合率先增大后減小，45 ℃時螯合率最高，達(dá)到48.41%，這可能是因為胰蛋白酶具有最適溫度，在該溫度下，底物與蛋白酶的接觸頻率增大，能使充分發(fā)生反應(yīng)[14]，低于或高于該溫度，酶的活性會受到影響，作用效率降低，從而影響水解度。螯合率與水解度間存在一定相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)（40～45 ℃），螯合率與水解度成正相關(guān)，因此，酶解溫度45 ℃時為最適溫度。

圖6 酶解溫度對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

2.2.4 酶解時間對DH及螯合率的影響

圖7所示在不同酶解時間條件下，花生蛋白酶解液的水解度與肽鋅螯合率的變化。

在不同酶解時間條件下，花生蛋白的水解度呈逐漸上升后趨于穩(wěn)定趨勢，同時，螯合率先上升后緩慢下降，在2 h時具有最高螯合率，達(dá)到49.81%，說明在低水解度也可以有較高螯合率。這與Khantaphan等[15]利用堿性蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解褐色條紋肌紅鯛魚蛋白酶解液，在低水解度亦有較高金屬螯合率的研究結(jié)果相符，綜合確定酶解時間為2 h。

圖7 酶解時間對花生蛋白DH和肽鋅螯合率的影響

2.3 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交法優(yōu)化酶解反應(yīng)的工藝條件。正交試驗因素水平表如表2所示，試驗方案及結(jié)果如表3所示。

由表3可知，這4個因素對螯合率影響的主次順序依次是D＞C＞A＞B，即酶解溫度＞pH＞酶解時間＞底物濃度。最佳酶解條件為A2B1C1D3，即取底物濃度3%、溫度50 ℃、pH 6，反應(yīng)時間2 h，在此條件下進(jìn)行驗證試驗，鋅離子螯合率為52.71%，高于正交試驗中的結(jié)果，可確定該組合為最優(yōu)組合。

表2 正交試驗因素水平表

表3 正交試驗方案及結(jié)果

3 結(jié)論

試驗以花生為原料，分別用堿性蛋白酶，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解花生蛋白，研究花生蛋白酶解產(chǎn)物鋅螯合率，獲得胰蛋白酶作為制備花生源鋅螯合肽的最佳酶。在單因素試驗基礎(chǔ)上，基于螯合率采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化制備花生肽的酶解工藝。正交試驗表明，酶解溫度對螯合率影響最大，其次依次是pH，酶解時間和底物濃度。最佳酶解條件為：底物濃度3%、酶解溫度50 ℃、pH 6、酶解時間2 h。在此條件下，花生肽的鋅螯合率為52.71%。研究對于拓寬花生肽的功能特性及新型補(bǔ)鋅劑開發(fā)具有參考價值。