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    新型冠狀病毒肺炎核酸檢測中的假陰性分析及對策*

    2020-03-03 12:46:58高維寅
    國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:核酸試劑盒陰性

    高維寅,張 洪,羅 陽

    (1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科,江西南昌 330006;2.重慶大學(xué)生物工程學(xué)院,重慶 400044;3.重慶大學(xué)醫(yī)學(xué)院智慧檢驗與分子醫(yī)學(xué)中心,重慶 400044)

    早在1937年,冠狀病毒首次從雞身上分離發(fā)現(xiàn),病毒顆粒的直徑為60~200 nm,平均直徑為100 nm,呈球形或橢圓形,具有多形性。病毒有包膜,包膜上存在棘突,整個病毒像日冕,不同的冠狀病毒的棘突有明顯的差異[1]。冠狀病毒感染細(xì)胞內(nèi)有時可以見到管狀的包涵體。新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒[2],其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和中東呼吸綜合征(MERS)-CoV[3]。冠狀病毒是一個大型病毒家族,已知輕癥可引起感冒類癥狀,重癥可引起MERS、SARS等。

    目前所知,冠狀病毒科僅感染脊椎動物,與人、動物的多種疾病密切相關(guān)[4]。研究認(rèn)為,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)是冠狀病毒感染的關(guān)鍵受體,只要表達(dá)ACE2受體的細(xì)胞均是冠狀病毒的侵襲對象[5]。研究觀察到ACE2定位于心臟、腎臟、肺、結(jié)腸和睪丸等組織中[6],也在多種組織中低表達(dá)。ACE2在肝臟和腸等器官中具有重要作用。ACE2通常定位于上皮細(xì)胞的腔面,這是導(dǎo)致冠狀病毒高感染力的重要原因,因為SARS冠狀病毒通過表達(dá)ACE2的細(xì)胞腔面進(jìn)行感染時,其感染效力更高。

    如何在早期進(jìn)行病毒鑒定是感染防控的關(guān)鍵。臨床常用的病毒病原學(xué)檢查主要包括病毒分離、病毒核酸檢測。病毒分離為實驗室檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”,病毒核酸檢測則用于快速診斷。受病毒感染機制影響,不同組織細(xì)胞中的SARS-CoV-2水平差異較大;而研究顯示SARS-CoV-2更趨向于結(jié)合肺泡上皮細(xì)胞,理論上來說其下呼吸道標(biāo)本較上呼吸道標(biāo)本病毒陽性檢出率更高[6]。因此收集標(biāo)本時盡量留取多種標(biāo)本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰或肺組織、血液和糞便)進(jìn)行檢測和分離,可以提高準(zhǔn)確性[7]。但對于短時間出現(xiàn)大量疑似患者,病毒分離遠(yuǎn)不能滿足臨床工作需要,并且病毒分離需要三級生物安全實驗室進(jìn)行,常規(guī)實驗室根本不具備上述條件,為確診工作帶來極大挑戰(zhàn)。

    1 假陰性原因分析

    2020年2月18日國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了COVID-19診療方案(試行第六版),明確COVID-19的確診方式有兩種:一種是實時熒光定量PCR(qPCR)檢測核酸呈陽性;第二種是病毒基因測序,與已知SARS-CoV-2高度同源。臨床上,大部分的高度疑似患者都采取方法一進(jìn)行檢測。因為相對基因測序而言,qPCR方式具有速度快、批量化、價格低等優(yōu)勢。然而,影響qPCR結(jié)果的因素很多,如標(biāo)本或核酸純化過程中出現(xiàn)的擴增反應(yīng)抑制物、擴增儀孔間溫度的差異以及核酸提取中的隨機誤差,均可造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。又如,以前擴增產(chǎn)物的污染和核酸提取中標(biāo)本間的交叉污染,也很容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此,對于qPCR檢測結(jié)果的報告必須慎重,尤其是會導(dǎo)致嚴(yán)重后果時。本次COVID-19疫情暴發(fā)后,“金標(biāo)準(zhǔn)”核酸檢測卻多次出現(xiàn)假陰性結(jié)果,特別是個別病例在不同時間經(jīng)5次以上的檢測后結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽性,為臨床診斷和疾病控制帶來極大的困難。對關(guān)鍵部位進(jìn)行標(biāo)本采集(早期為咽拭子,第六版指南建議為痰標(biāo)本)成為臨床科室性價比最高的選擇[1]。因此,本文重點結(jié)合臨床科室的具體實踐,針對臨床診斷陽性而核酸檢測顯示為假陰性的結(jié)果進(jìn)行剖析,總結(jié)出導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的三大因素,希望有助于檢驗時機的把握,為下一步打贏疫情阻擊戰(zhàn)提供參考。

    1.1太早 (1)檢測試劑不成熟:一個新病毒的出現(xiàn),從分離到測序、鑒定,研發(fā)出成熟的試劑盒,需要一定的時間周期。隨著人類對疾病認(rèn)識的深入,試劑盒本身還會逐漸優(yōu)化,其特異性和準(zhǔn)確性必定會進(jìn)一步提升。目前核酸檢測多采用qPCR技術(shù),其檢測原理決定了大多數(shù)試劑盒的檢測靈敏度為100~500拷貝,這些試劑盒對于高濃度病毒檢出問題不大,但是不同廠家甚至于不同批次的試劑盒對于“灰區(qū)”的判定則明顯不一致。(2)疾病病程早:大部分假陰性患者處于疾病發(fā)展的早期。從現(xiàn)有文獻(xiàn)報道來看,COVID-19潛伏期長達(dá)14 d,個別病例甚至達(dá)到了29 d,早期臨床表現(xiàn)不典型,一旦進(jìn)入快速發(fā)展期,病程進(jìn)展極快[8]。在感染早期,病毒復(fù)制數(shù)量達(dá)不到qPCR檢測閾值的時候,出現(xiàn)假陰性不可避免。

    1.2太多 待測的疑似病例數(shù)量多,有待排除感染的標(biāo)本多,檢測操作步驟多。根據(jù)國家對傳染病管理的規(guī)定,陽性病例標(biāo)本必須要送至疾病預(yù)防控制中心才能夠確認(rèn)。然而,這樣長時間轉(zhuǎn)運標(biāo)本極易導(dǎo)致病毒RNA的降解。后來國家下放確認(rèn)權(quán)限,允許具備臨床擴增實驗室資質(zhì)并且防護(hù)驗收合格的醫(yī)療機構(gòu)檢驗科開展檢測。但在本次疫情之前,大多數(shù)實驗室均處于基本滿足臨床需要的狀態(tài),少有富余檢測能力,在疑似病例大量出現(xiàn)的情況下,每日檢測數(shù)量超過實驗室既定極限,有的標(biāo)本不得不被延遲檢測(只有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的實驗室才有發(fā)布報告的權(quán)限)。標(biāo)本難以做到即時送檢,只能是采集1批,留存1批,檢測1批,報告1批。許多標(biāo)本都處于保存和檢測時間范圍的極值,甚至部分標(biāo)本已經(jīng)超過檢測的最佳時限(后來這種情況隨著實驗室的快速改建擴容,送檢流程的優(yōu)化得到明顯的改善)。

    由于疫情嚴(yán)重、發(fā)展迅速。在疫情暴發(fā)初期,防護(hù)裝備極為匱乏,為減少醫(yī)務(wù)人員感染病毒的風(fēng)險,臨床上在留取標(biāo)本的時候也盡可能采取集中采樣的方式,這也會影響標(biāo)本采集的效果。醫(yī)護(hù)人員工作量過多,迫使大量非重癥和呼吸專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員補充進(jìn)來,對鼻、咽拭子采集流程和規(guī)范的不熟悉導(dǎo)致采樣標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一,取樣部位不準(zhǔn)確,導(dǎo)致標(biāo)本陽性率下降。

    1.3太雜 從有確診患者以來,COVID-19診治指南已發(fā)布多個版本。從湖北版指南、廣東版指南到最后的全國統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),盡管標(biāo)準(zhǔn)逐漸統(tǒng)一,但是很多一線操作人員對臨床具體取樣過程缺乏統(tǒng)一認(rèn)識,仍舊采用陳舊的操作方式。目前的取樣涵蓋了血液、鼻拭子、咽拭子、肺泡灌洗液、排泄物、普通患者的痰液、插管患者的下呼吸道分泌物等標(biāo)本類型。同時,對同一患者不同部位取樣進(jìn)行核酸檢測,陽性率的統(tǒng)計學(xué)差異極有可能源于生理性差異。第六版診治指南發(fā)布以后,公開報道的假陰性患者明顯減少,這與全面實施規(guī)范化采樣過程關(guān)系密切。

    2 對 策

    COVID-19具有高傳染性、高隱匿性和高致病性,人們對于COVID-19的致病機制、臨床特點以及傳播途徑均存在著認(rèn)識上的局限[9],相信隨著人類與COVID-19疫情的斗爭,對疾病的認(rèn)識會進(jìn)一步深入和更加全面。目前可以從以下幾個方面進(jìn)行規(guī)范,以減少檢測中的假陰性。

    2.1綜合采用其他實驗室檢測手段 可以采用數(shù)字PCR等技術(shù)來對qPCR進(jìn)行補充,特別是對于qPCR檢測陰性或者弱陽性標(biāo)本,可以有效克服qPCR靈敏度不足的難題,適用于早期感染的判斷及患者治愈后的出院診斷。同時,對SARS-CoV-2抗原和抗體進(jìn)行動態(tài)定量檢測也有助于識別感染者。目前,基于抗原檢測的試劑不多,大多數(shù)試劑盒采用免疫球蛋白(Ig)M/IgG聯(lián)合檢測以提高準(zhǔn)確性。最新的研究報道,核酸檢測陰性但臨床癥狀確診的COVID-19患者中,IgM陽性率達(dá)到84.21%,IgG陽性率達(dá)到94.74%。聯(lián)合抗體和核酸檢測診斷COVID-19的總符合率為88.03%[10]。另外,結(jié)合實驗室的其他炎癥、凝血等指標(biāo)進(jìn)行綜合分析,也具有指導(dǎo)意義。聯(lián)合白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、C-反應(yīng)蛋白、血清淀粉樣蛋白A等檢測指標(biāo)可以提高診斷COVID-19的特異度和靈敏度,對重型和危重型COVID-19的診斷同樣有較高的參考價值[11]。淋巴細(xì)胞亞群和白細(xì)胞介素-6等炎性指標(biāo)也可以用于輔助病情診斷。另外,降鈣素原可用來評估COVID-19患者是否有繼發(fā)感染及感染的嚴(yán)重程度。

    2.2規(guī)范標(biāo)本采集方式和過程 有條件的地區(qū),在規(guī)范進(jìn)行呼吸道標(biāo)本采集和檢測的基礎(chǔ)上,盡可能完善其他部位標(biāo)本采集(特別是合并消化道癥狀患者),對減少假陰性結(jié)果可能有積極的意義。建議進(jìn)行不同臨床標(biāo)本檢測結(jié)果差異比對的臨床試驗,從而進(jìn)一步規(guī)范標(biāo)本來源;通過正規(guī)培訓(xùn)和監(jiān)管來規(guī)范采樣過程并重視檢驗前的標(biāo)本采集和保存工作。

    2.3嚴(yán)格檢測試劑的監(jiān)管和審批 即便是再先進(jìn)的檢測技術(shù),也需要檢測儀器和試劑來承載。因此,不同廠家的試劑盒質(zhì)量、陰(陽)性質(zhì)控品、批間差異等指標(biāo)顯得尤為重要。在疫情趨于平緩后,相關(guān)部門應(yīng)該加強對各種檢測試劑盒的監(jiān)管工作,鼓勵各檢測產(chǎn)品和臨床擴增實驗室配合臨床檢驗中心進(jìn)行室間質(zhì)評以進(jìn)行系統(tǒng)性評估。

    總而言之,實驗室診斷只是能作為SARS-CoV-2檢測的重要手段之一,不能孤立地?fù)?jù)此進(jìn)行結(jié)果判斷。因為對該病毒的了解還不夠深入,有效的潛伏期篩查手段尚未建立,臨床上更應(yīng)該重視患者的早期癥狀和影像學(xué)表現(xiàn),將核酸檢測作為臨床診斷的“守門人”,并且配合多項實驗室檢查進(jìn)行判斷。實驗室檢測和臨床診斷應(yīng)當(dāng)結(jié)合起來共同應(yīng)對這個新型的病毒。

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