首發(fā)抑郁障礙患者治療前后外周血單核細(xì)胞微小RNA-16表達(dá)的變化

王鷺，張迪，曹峰

抑郁障礙以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征;研究[1]顯示，抑郁障礙患者的傷殘損失壽命年(YLD)在全球十大致殘疾病中居首位；迄今病因不清楚。臨床上以描述性診斷為主，尚沒(méi)有明確的實(shí)驗(yàn)室客觀指標(biāo)。深入研究[2-5]發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是抑郁障礙動(dòng)物模型或患者的腦組織、外周血單核細(xì)胞(PBMC)中均有微小(mi)RNA表達(dá)異常；抑郁障礙的病理生理過(guò)程與miRNA功能失調(diào)或應(yīng)答改變密切相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6-7]已證實(shí)miRNA-16可抑制5-羥色胺(5-HT)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)；下調(diào)中縫核miRNA-16表達(dá)可改善抑郁癥狀；且氟西汀可降低大腦中縫的 miRNA-16 濃度，間接影響5-HT 神經(jīng)元的合成及功能，保證了神經(jīng)元的正常功能，使抑郁癥狀得到改善。經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究動(dòng)態(tài)檢測(cè)接受帕羅西汀治療的初發(fā)抑郁障礙患者PBMC miRNA-16 的表達(dá)水平，探討其對(duì)抑郁障礙診斷及評(píng)估病情的價(jià)值。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

患者組：為本院2017年1月至2019年1月在本院治療的18～60歲首發(fā)抑郁障礙患者150例；入組者均符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-IV)抑郁障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)；漢密爾頓抑郁量表17項(xiàng)版本(HAMD-17)評(píng)分>17分；病程<3個(gè)月、且未曾服抗抑郁藥；排除患有癲癇、嚴(yán)重軀體疾病及其他精神疾病、物質(zhì)依賴、嚴(yán)重自殺企圖及行為的患者。所有患者都由家屬簽屬知情同意書(shū)。治療過(guò)程中因各種原因中途退出24例，完成觀察126例，其中男59例，女67例；年齡(43.4±18.5)歲。對(duì)照組：同期選取與患者組性別、年齡相匹配的本院健康醫(yī)護(hù)人員30名，均無(wú)抑郁障礙及其他精神疾病家族史，其中男14名，女16名；年齡(43.1±17.8)歲。兩組性別、年齡方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 藥物治療方法 患者入組后即接受帕羅西汀片(天津中美史克制藥公司)單藥治療，初始劑量20 mg/d，根據(jù)病情變化調(diào)整劑量，最大劑量≤40 mg/d，療程8周；平均劑量(28.52±5.94)mg/d。

1.2.2 療效評(píng)價(jià)方法 分別于治療前、治療第1、2、4、8周給予患者HAMD-17評(píng)估，以治療結(jié)束時(shí)HAMD減分率將患者分組，減分率≥75%為A組；50%～74%為B組，25%～49%為C組，<25%為D組。

1.2.3 PBMC miRNA-16水平檢測(cè) 患者組分別于治療前、治療后第1、2、4、8周及對(duì)照組入組時(shí)抽取留取外周靜脈血4 ml，枸櫞酸鈉抗凝；采用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，用RNA提取試劑盒(miRNeasy Mini Kit)提取總RNA，熒光定量PCR法檢測(cè)miRNA-16表達(dá)量；用FICOLL-PAQUE分離液分離PBMCs；總RNA提取嚴(yán)格按照miRNeasy Mini Kit說(shuō)明書(shū)上步驟實(shí)施；cDNA的合成按以下配方配置反應(yīng)液：5×RT緩沖液2 μl，模板RNA X μl，miR-16反轉(zhuǎn)錄引物0.5 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl， dNTP Mixture 1 μl，RNase inhibitor 0.5 μl，RNase free H2O 5.5-X μl；總體積10 μl。配好的反應(yīng)液置于PCR儀中45℃反應(yīng)45 min；后調(diào)至95℃反應(yīng)5 min；最后冰浴5 min。將合成的cDNA置于-20℃冰箱中保存。Real-time PCR配置體系：cDNA模板 4 μl，PCR Forward primer 1 μl，PCR Reverse primer 1 μl，2×SYBR Green mix 25 μl， Tap DNA Polymerase 0.3 μl，ddH2O 18.7 μl。PCR循環(huán)條件94℃ 2 min→94℃ 10 s→60℃ 15 s →72℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)采集在每循環(huán)第3步反應(yīng)時(shí)；熒光定量PCR的結(jié)果以每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)Ct表示。miRNA-16與U6(反轉(zhuǎn)錄引物)相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt值表示。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMC miRNA-16表達(dá)比較

治療前患者組PBMC miRNA-16相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；隨著治療進(jìn)行患者組PBMC miRNA-16相對(duì)表達(dá)量逐漸下降(P<0.01)；但各時(shí)間點(diǎn)仍明顯高于對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組PBMC miRNA-16表達(dá)水平的比較值)

2.2 患者組亞組間PBMC miRNA-16表達(dá)比較

治療前亞組間PBMC miRNA-16相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后各亞組miRNA-16表達(dá)明顯低于治療前(P均<0.01)，呈現(xiàn)D組>C組>B組>A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 亞組間PBMC miRNA-16表達(dá)比較值)

2.3 患者組PBMC miRNA-16表達(dá)水平與HAMD評(píng)分的相關(guān)性分析

患者組miRNA-16表達(dá)水平與HAMD評(píng)分呈正相關(guān)性(r=0.432，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

圖1患者PBMC miRNA-16表達(dá)與HAMD評(píng)分相關(guān)性分析

3 討論

迄今為止，抑郁障礙的病因并不清楚，多年來(lái)一直停留在描述性診斷階段，阻礙了抑郁障礙的有效治療和后期康復(fù)。但可以肯定的是，生物、心理與社會(huì)環(huán)境諸多方面因素參與了抑郁障礙的發(fā)病過(guò)程；生物學(xué)因素主要涉及遺傳、神經(jīng)生化、神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)再生等方面。miRNA是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)。研究[8]表明miRNAs轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因調(diào)控功能的異常與神經(jīng)精神疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程有著密切關(guān)系。有研究[9]認(rèn)為 PBMC miRNAs異常表達(dá)可能參與了抑郁障礙的發(fā)病機(jī)制；袁梅菊等[10]研究顯示，抑郁障礙患者PBMC表面miRNA-124表達(dá)水平與抑郁障礙的診斷、治療效果關(guān)系密切；可作為抑郁障礙診斷和評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物。

miRNA可能參與抑郁癥的發(fā)病的機(jī)制有：①單胺機(jī)制：?jiǎn)伟飞窠?jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺(5-HT)、多巴胺和去甲腎上腺素等功能低下與抑郁癥的抑郁心境、運(yùn)動(dòng)抑制、焦慮不安、睡眠障礙、不能應(yīng)對(duì)刺激及內(nèi)分泌功能失調(diào)等癥狀有關(guān)[11-13]，作為抑郁癥情緒調(diào)控異常機(jī)制的候選基因，5-HT2A基因主要對(duì)額葉功能異常造成影響[14]，miR-195 在轉(zhuǎn)錄后參與了該基因的調(diào)控。Launay等[15]發(fā)現(xiàn)5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)被miR-16所抑制，研究通過(guò)下調(diào)中縫核miR-16表達(dá)使抑郁癥狀大大改善。②神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子機(jī)制：miR-132、miR-195既可調(diào)控5-HT受體，也參與調(diào)控腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和谷氨酸受體。針對(duì)抑郁大鼠模型進(jìn)行的研究[16]顯示，額葉皮質(zhì)miR-22、miR-200b、miR-211和miR-300可能通過(guò)抑制cAMP反應(yīng)結(jié)合蛋白 (CREB)表達(dá)，使大鼠神經(jīng)突觸減少及樹(shù)突棘形態(tài)異常來(lái)參與抑郁癥的病理生理過(guò)程。

對(duì)抑郁癥藥物研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在針對(duì)大鼠的實(shí)驗(yàn)中，長(zhǎng)期給予氟西汀會(huì)降低大腦中縫的 miR-16 濃度，同時(shí)降低了5-HT 轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)蛋白水平。SERT 是5-HT 再攝取抑制劑(SSRI)最為重要的作用靶點(diǎn)。在氟西汀藥物的作用下，5-HT 神經(jīng)元能釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，其通過(guò)降低 miR-16 表達(dá)對(duì)去甲腎上腺素能神經(jīng)元發(fā)揮作用，進(jìn)而影響SERT蛋白表達(dá)，間接影響5-HT 神經(jīng)元的合成及功能，保證神經(jīng)元的正常功能，改善了抑郁癥狀。

本研究中，治療前患者PBMC miRNA-16表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，隨著治療進(jìn)行，PBMC miRNA-16表達(dá)水平逐漸下降，但各時(shí)點(diǎn)仍顯著高于對(duì)照組；提示PBMC miRNA-16表達(dá)水平可能是抑郁障礙的生物標(biāo)志物之一。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，治療前不同療效組患者PBMC miRNA-16表達(dá)水平無(wú)明顯差異，治療后均較治療前明顯降低(P均<0.01)；治療后PBMC miRNA-16表達(dá)水平呈現(xiàn)D組>C組>B組>A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；相關(guān)性分析顯示，患者miRNA-16表達(dá)水平與HAMD評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.432，P=0.000)；提示PBMC miRNA-16表達(dá)水平或許可作為評(píng)估抑郁障礙患者病情的生物標(biāo)記物之一。