金槍魚粉的酶解工藝及其酶解產(chǎn)物功能活性研究

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(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,浙江寧波 315100; 2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校制藥工程學(xué)院,浙江寧波 315100)

金槍魚(Tuna)作為深?！棒~中之王”,肉質(zhì)蛋白質(zhì)高、脂肪低,氨基酸組成與人體需求接近,富含二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不飽和脂肪酸[1],是一種營(yíng)養(yǎng)食材。金槍魚加工制作罐頭和生魚片過(guò)程中產(chǎn)生大量的邊角料[2],由于受加工及保藏條件限制,金槍魚邊角料一般經(jīng)簡(jiǎn)單的粗加工生產(chǎn)魚粉被作為飼料、肥料出售。由于金槍魚邊角料中蛋白質(zhì)含量高,如何將這些蛋白資源高值化利用,對(duì)于金槍魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

將金槍魚邊角料烘干打成粉俗稱金槍魚粉,采用酸水解、堿水解、酶解或者是菌酶協(xié)同處理方法,可以得到金槍魚的水解多肽和氨基酸。由于酶解法具有反應(yīng)條件溫和、破壞原有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)少、無(wú)污染、酶解蛋白水溶性好等特點(diǎn),越來(lái)越多地被應(yīng)用于水產(chǎn)蛋白粉的研究中[3]。Hsu[4-5]采用木瓜蛋白酶(PA)和蛋白酶XXIII(PR)水解金槍魚黑肌肉副產(chǎn)物,純化蛋白水解產(chǎn)物,評(píng)價(jià)了其抗氧化性和對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抗增殖活性,結(jié)果表明,分子量為390～1400 Da的肽組分具有抗氧化和抗增殖活性,并測(cè)定了從PA和PR水解產(chǎn)物中分離出的兩個(gè)抗增殖肽的氨基酸序列,分別是Leu-Pro-His-Val-Leu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Thr(1206 Da)和Pro-Thr-Ala-Gly-Gly-Val-Tyr-Met-Val-Thr(1124 Da),它們顯示了對(duì)MCF-7細(xì)胞體外的劑量依賴性抑制作用,IC50值分別為8.1和8.8 μmol·L-1,表明金槍魚黑肌肉副產(chǎn)品中的抗氧化和抗增殖酶解物可能是食品和營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用中的有用成分。

金槍魚副產(chǎn)物來(lái)源、酶制劑選擇以及酶解工藝不同都影響著酶解效果。如陳啟航等[6]對(duì)金槍魚蒸煮液進(jìn)行酶解的最佳酶制劑為木瓜蛋白酶,在56 ℃、添加量300 U/g條件下酶解4 h,此時(shí)水解度為27.44%±0.04%。王雨生等[7]為了從金槍魚皮制備膠原蛋白肽,從木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶中篩選出金槍魚皮酶解的最佳蛋白酶是中性蛋白酶,酶添加量1000 U/g金槍魚皮、酶解4 h,肽得率29.03%。文獻(xiàn)報(bào)道[8]利用胰蛋白酶對(duì)金槍魚暗色肉酶解制備的酶解液中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的42.38%,可作食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。金槍魚副產(chǎn)物的相關(guān)酶解產(chǎn)物在飼料、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究均有報(bào)道[9-10]。

為了提高金槍魚粉附加值,本研究以金槍魚粉為原料,以水解度(Degree of hydrolysis,DH)為指標(biāo),通過(guò)適宜于金槍魚粉的酶制劑優(yōu)選,篩選出合適又經(jīng)濟(jì)的金槍魚粉水解蛋白酶,以單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定金槍魚粉酶解蛋白肽的制備新工藝。在此基礎(chǔ)上,對(duì)金槍魚酶解物進(jìn)行抗氧化性、對(duì)酪氨酸酶抑制性、以及抑菌性等功能性實(shí)驗(yàn),以期為金槍魚粉的高效酶解產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和其綜合應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚粉 金槍暗色肉邊角料5 ℃烘干,粉碎過(guò)30目篩備用,蛋白質(zhì)含量為61.56%,寧波豐肽生物科技有限公司提供,冰箱-18～0 ℃保存;胰蛋白酶 0.4萬(wàn)U·g-1,國(guó)藥集團(tuán);中性蛋白酶 80萬(wàn)U·g-1,江蘇銳陽(yáng)生物科技公司;堿性蛋白酶 20萬(wàn)U·g-1,寧波豐肽生物科技有限公司;風(fēng)味蛋白酶 3萬(wàn)U·g-1,寧波豐肽生物科技有限公司;大腸桿菌 浙江萬(wàn)里學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;甲醛-水溶液(37%～40%)、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)。

BP121S精密天平 上天精密儀器有限公司;6～16 k低速大容量冷凍離心機(jī) Sigma公司;PH-100A pH計(jì) 邦西儀器科技有限公司;SH220N石墨消解儀 上海卓好實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚粉的酶解工藝

取一定量的金槍魚粉于適量的純化水中,攪拌均勻后,用6 mol·L-1NaOH溶液調(diào)整混合液的pH,再加入適量的酶制劑,恒溫?cái)嚢杳附?。酶解結(jié)束后于100 ℃滅酶15 min,以4000 r·min-1離心酶解混合液10 min,得到酶解液。

1.2.2 金槍魚粉酶解的酶制劑篩選與單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酶制劑篩選 取金槍魚粉5 g,按1∶5料液比加蒸餾水,按2500 U·g-1(魚粉)分別添加風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶,酶解6 h(酶解液pH和溫度選擇為各商品酶的最適條件)。以水解度為指標(biāo)比較各蛋白酶對(duì)金槍魚粉的酶解效果。

1.2.2.2 料液比對(duì)水解度的影響 取5 g金槍魚粉5份,按料液比為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9 (g/mL)加水?dāng)噭?用6 mol·L-1NaOH調(diào)pH至10,按2500 U·g-1加入堿性蛋白酶,在55 ℃酶解6 h。其余操作按“1.2.1”項(xiàng)。取酶解液測(cè)定水解度。

1.2.2.3 加酶量對(duì)水解度的影響 取5 g金槍魚粉5份,按料液比1∶5加水?dāng)噭?加酶量為0.5×104、0.75×104、1×104、1.25×104、1.5×104U·g-1原料,其它酶解條件同“1.2.2.2”。

1.2.2.4 酶解液pH對(duì)水解度的影響 取5 g金槍魚粉6份,按料液比1∶5加水?dāng)噭?加入堿性蛋白酶10000 U·g-1原料,用6 mol·L-1NaOH分別調(diào)pH至7、8、9、10、11、12,在溫度55 ℃酶解6 h,其它酶解條件同“1.2.2.2”。

1.2.2.5 酶解溫度對(duì)水解度的影響 取5 g金槍魚粉5份,按料液比1∶5加水?dāng)噭?加入堿性蛋白酶10000 U·g-1原料,用6 mol·L-1NaOH分別調(diào)pH至10,在溫度分別為45、50、55、60、65 ℃下酶解6 h,其它酶解條件同“1.2.2.2”。

1.2.2.6 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 取5 g金槍魚粉5份,按料液比1∶5加水?dāng)噭?加入堿性蛋白酶10000 U·g-1原料,在溫度55 ℃,pH為10.0的條件下分別酶解3、6、7.5、9、12 h。其它酶解條件同“1.2.2.2”。

1.2.3 金槍魚粉酶解的響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以水解度為指標(biāo),根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)法進(jìn)行3因數(shù)3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定堿性蛋白酶解金槍魚粉的最佳工藝條件,實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 水解度測(cè)定 總氮含量N(g·100 mL-1)根據(jù)GB 5009.5-2010凱氏定氮法測(cè)定;氨基酸態(tài)氮含量n(g·100 mL-1)根據(jù)GB 5009.235-2016甲醛滴定法測(cè)定。水解度DH按下式計(jì)算[11]:

1.2.5 金槍魚粉酶解液的功效性測(cè)定

表3 不同酶對(duì)金槍魚粉水解度的影響Table 3 Effects of different kinds of proteases on hydrolysis degree of tuna powder

1.2.5.1 金槍魚粉酶解液樣品制備 按“1.2.3”項(xiàng)優(yōu)化工藝條件制備,濃縮后得到氨基酸態(tài)氮含量為7.57 mg·mL-1的金槍魚粉酶解液。

1.2.5.2 對(duì)羥自由基清除率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]。取9 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1 mL、9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL于試管中,分別加入稀釋15、20、25、30、35倍的酶解液1 mL,最后加8.8 mmol·L-1過(guò)氧化氫溶液1 mL啟動(dòng)反應(yīng),37 ℃反應(yīng)30 min,于510 nm測(cè)吸光度,記為Ax。以1 mL蒸餾水代替酶解液作空白,記為A0。以1 mL蒸餾水代替H2O2作酶解液本底,記為Ax0。

1.2.5.3 總還原力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]。在試管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL酶解液樣品,用蒸餾水稀釋至1.0 mL,同時(shí)取1.0 mg·mL-1維生素C 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL并用蒸餾水稀釋至1.0 mL為參照。分別加入0.2 mol·L-1、pH6.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)2.5 mL,再加入1%鐵氰化鉀2.5 mL,混勻,于50 ℃水浴20 min,加入10%三氯乙酸1 mL混勻,離心,取2.5 mL上清液,加蒸餾水2.5 mL和0.1%氯化鐵0.5 mL,放置15 min后于700 nm處測(cè)吸光度。

1.2.5.4 對(duì)酪氨酸酶抑制率測(cè)定 參照唐煜括等[12]方法。量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL樣品,再用蒸餾水稀釋至1.0 mL,備用,按表2將PBS緩沖液(pH6.6)、金槍魚酶解液、5 mmol·L-1的L-酪氨酸溶液加好后于37 ℃保溫10 min,再加入100 U·mL-1的酪氨酸酶混勻,于37 ℃保溫30 min后立即測(cè)定475 nm吸光度。酶解液對(duì)酪氨酸酶抑制率如下計(jì)算:

表2 金槍魚酶解液對(duì)酪氨酸酶抑制率的反應(yīng)液組成Table 2 Composition of reaction liquid of tuna lysate against tyrosinase

1.2.5.5 對(duì)大腸桿菌的抑制實(shí)驗(yàn) 參照王葉青等[13]方法。取用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后的不同濃度1.52～121.6 μg·mL-1(以氨基態(tài)氮濃度計(jì))的金槍魚酶解液100 μL,加入到含有5 mL的LB培養(yǎng)基中,再分別加入50 μL活化好的大腸桿菌菌液(107～108CFU·mL-1),于37 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h,測(cè)定540 nm處大腸桿菌培養(yǎng)液的吸光度AX,同時(shí)以100 μL無(wú)菌蒸餾水代替酶解液作對(duì)照A0,計(jì)算抑菌率(%)=(A0-AX)×100/A0。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑篩選

由表3可知,四種蛋白酶對(duì)金槍魚粉的水解度為:堿性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶。由于添加酶制劑的量較低,總體水解度偏低。酶解效果以堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶較好,水解度大于14%。堿性蛋白酶可作用于色氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸等形成的多種肽鍵,酶切位點(diǎn)較多，能較徹底地水解底物蛋白[14],且堿性蛋白酶性價(jià)比高,考慮工業(yè)化生產(chǎn)成本,選擇堿性蛋白酶為金槍魚粉的酶制劑。

2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)水解度的影響 由圖1可知,隨著料液比增加,水解度呈先增大再減小的變化趨勢(shì),在料液比為1∶5時(shí),金槍魚粉酶解液的水解度最大。這是因?yàn)榱弦罕葘?duì)體系的粘稠度有影響,當(dāng)料液比較小時(shí),酶解液粘度較大,不利于酶制劑和酶解產(chǎn)物的擴(kuò)散;當(dāng)料液比較高時(shí),不利于酶與底物充分接觸,也不利于酶解[15]。因此,選擇料液比為1∶5。

圖1 料液比對(duì)水解度影響Fig.1 Effects of material liquid ratio on hydrolysis degree

2.2.2 加酶量對(duì)水解度的影響 由圖2可知,隨著加酶量增加，水解度增大,當(dāng)加酶量為10000 U·g-1原料時(shí),蛋白水解度為25.15%±0.30%,之后酶量增加對(duì)水解度影響趨于平緩。增加酶制劑用量,可以提高底物與酶的接觸率,加速酶解反應(yīng)進(jìn)程,提高水解度。隨著酶解產(chǎn)物濃度的提高,產(chǎn)物與未作用的酶有可能形成復(fù)合物,阻礙底物與酶的作用,減緩水解進(jìn)程[16],因此選用10000 U·g-1原料為最適加酶量。

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2 Effects of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

2.2.3 酶解液pH對(duì)水解度的影響 由圖3可知,酶解效果受酶解液pH影響大,隨pH的增大水解度增大,在pH為11時(shí),水解度達(dá)到最大,當(dāng)pH為12時(shí),水解度急劇下降。這是因?yàn)閺?qiáng)堿對(duì)堿性蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)有極大的破壞作用,使其失去相應(yīng)的活性[17]所致。本實(shí)驗(yàn)選擇酶解液pH為11。

圖3 酶解液pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effects of pH value on the degree of hydrolysis

2.2.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響 由圖4可知,隨著酶解溫度的升高,酶活性增強(qiáng),酶促反應(yīng)加快,水解度增大。55 ℃時(shí),水解度達(dá)最大值。繼續(xù)升高溫度,水解度反而下降。這是因?yàn)槊附鉁囟冗^(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵解體,酶蛋白變性,酶活力減弱[18]。因此,堿性蛋白酶酶解金槍魚粉最適溫度為55 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effects of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖5可知,隨酶解時(shí)間增加,酶解液的水解度增大,當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到9 h時(shí),水解度變化趨緩。因?yàn)槊附鈩傞_始時(shí),底物和酶的質(zhì)量濃度均比較高,接觸面積較大,酶解速度較快,水解度增幅較大;隨著反應(yīng)進(jìn)行,酶量減少,酶解液中游離肽不斷積累,水解度趨緩。當(dāng)酶解時(shí)間為7.5、9、12h時(shí),對(duì)應(yīng)的水解度分別是25.85%±0.28%、26.92%±0.42%、26.63%±0.11%,差異不大。所以后續(xù)進(jìn)一步對(duì)酶解時(shí)間在7.5～12 h進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Effects of reaction time on the degree of hydrolysis

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇酶解時(shí)間、酶解液pH與溫度進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn),以水解度為指標(biāo),結(jié)果見表4。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of regression model

注:P<0.05、P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of RSM test

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 利用Design Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到水解度的二次項(xiàng)回歸模型方程為:

DH(%)=29.64-1.22A+0.036B-5.46C-0.47AB-1.08AC+0.63BC-0.61A2-4.13B2-7.15C2

表5為回歸模型的方差分析,該模型的P值小于0.0001,表明二次回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)P=0.017>0.01,說(shuō)明該回歸方程擬合度良好;模型的校正系數(shù)表明響應(yīng)值的變化有97.44%是有所選因數(shù)引起的,說(shuō)明該模型能正確反映水解度與時(shí)間、溫度和pH之間的關(guān)系。

圖6 酶解溫度與pH的交互作用對(duì)金槍魚粉水解度的影響Fig.6 Effect of temperature of enzymatic hydrolysis and pH on hydrolysis degree of tuna powder

酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解液pH的F值大小為:C>A>B,可知對(duì)于水解度DH影響因素強(qiáng)弱順序?yàn)?酶解液pH>酶解時(shí)間>酶解溫度。一次項(xiàng)A、C影響極顯著(P<0.01),B影響不顯著(P>0.05);二次項(xiàng)A2顯著(P<0.05),B2、C2極顯著(P<0.01);交互項(xiàng)中AC極顯著(P<0.01),AB、BC顯著(P<0.05),表明酶解溫度、酶解時(shí)間、以及酶解液pH兩兩相互之間對(duì)酶解效率均有協(xié)同作用。各因子的交互作用對(duì)結(jié)果影響見圖6～圖8。由圖6～圖8可知,酶解液pH、酶解時(shí)間、酶解溫度兩兩之間的交互作用顯著。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)Design Expert 8.0軟件分析得出,最佳工藝參數(shù)為:酶解時(shí)間8.13 h,酶解溫度55.10 ℃,酶解液pH10.67,模型對(duì)水解度的理論預(yù)測(cè)值30.97%。考慮到試驗(yàn)的可行性,按照酶解時(shí)間8 h,酶解溫度55 ℃,酶解液pH10.5進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)。得到水解度為29.20%±0.08%,與理論值接近,相對(duì)誤差為6.08%。

圖7 酶解時(shí)間與溫度的交互作用對(duì)金槍魚粉水解度的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolysis time and temperature on the hydrolysis degree of tuna powder

圖8 酶解時(shí)間與pH的交互作用對(duì)金槍魚粉水解度的影響Fig.8 Effects of enzymatic hydrolysis time and pH on hydrolysis degree of tuna powder

說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶水解金槍魚粉的工藝參數(shù)是可行的,模型具有較好的可靠性。

2.4 金槍魚酶解液的生物活性

2.4.1 金槍魚酶解液對(duì)羥自由基清除結(jié)果 由圖9可知,金槍魚酶解液對(duì)羥自由基清除率隨酶解液中氨基態(tài)氮濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)氨基態(tài)氮濃度為0.5047 mg·mL-1時(shí),其清除率可達(dá)80%,且濃度再增加,其清除率趨于穩(wěn)定。金槍魚粉酶解產(chǎn)物主要含氨基酸、小分子多肽等,這些物質(zhì)可與Fe2+結(jié)合阻斷羥自由基生成,清除羥自由基。Hsu等[19]從金槍魚煮汁中分離到富含Glu、Ala、Asp的抗氧化活性肽。

圖9 金槍魚酶解液對(duì)羥自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of the enzymatic hydrolysates of tuna to hydroxyl radical

2.4.2 酶解液總還原力 還原力可以判定酶解液是否為優(yōu)良的電子供體,一般情況下,物質(zhì)的還原力與抗氧化力呈正相關(guān)。由圖10可知,隨著金槍魚粉酶解液中氨基態(tài)氮濃度增加,總還原力增強(qiáng)。當(dāng)氨基態(tài)氮濃度為7.57 mg·mL-1時(shí),其還原力與0.4 mg·mL-1維生素C接近。金槍魚粉酶解液的還原力大小與其水解后多肽、氨基酸中羥基增加有關(guān),這些基團(tuán)有利于與Fe3+結(jié)合并將其還原為Fe2+[20]。

圖10 金槍魚粉酶解液與維生素C的總還原力對(duì)比Fig.10 Comparison of total reducing power between enzymatic hydrolysate of tuna powder and vitamin C

2.4.3 酶解液對(duì)酪氨酸酶的抑制作用 由圖11可知,酶解液濃度對(duì)酪氨酸酶的抑制率呈線性關(guān)系,線性方程為y=9.749x+16.46(r=0.9617),當(dāng)酶解液中氨基酸態(tài)氮含量為7.57 mg·mL-1時(shí),對(duì)酪氨酸酶的抑制率達(dá)到了84.8%,其半數(shù)抑制率為IC50=3.44 mg·mL-1。酶解液中的小分子多肽可與酪氨酸酶結(jié)合,破壞酪氨酸酶的活性中心,導(dǎo)致酪氨酸酶失活[21]。

圖11 金槍魚酶解液對(duì)酪氨酸酶抑制作用Fig.11 Inhibition of tuna enzymolysis liquid on tyrosinase

2.4.4 酶解液的抑菌作用 由圖12可知,加入酶解液的培養(yǎng)基,具有抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的作用,并且抑菌效果隨氨基態(tài)氮濃度增加而升高。李慧等[22]的研究結(jié)果表明,從黃鰭金槍魚皮酸化后的提取液中分離出分子量為3.4 kDa的多肽,對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出強(qiáng)效的抑制作用,且不具有溶血性,是研制藥物、食品和飼料添加劑的潛在物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金槍魚酶解液有抑菌作用,表明含有抗菌多肽。

圖12 金槍魚酶解液對(duì)大腸桿菌的抑制作用Fig.12 Inhibition of tuna enzymolysis liquid on E.coli

金槍魚粉酶解液的功能性實(shí)驗(yàn)證明了酶解液具有較好的抗氧化性、酪氨酸酶抑制性和一定的抑菌性,這一結(jié)果與文獻(xiàn)[23-24]的研究結(jié)果相似。這為其作為功能性食品、飼料添加劑提供了應(yīng)用依據(jù),也為后續(xù)分離純化活性組分奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究以金槍魚魚粉為原料,以水解度為評(píng)定指標(biāo),從胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶中篩選出堿性蛋白酶為金槍魚粉的最適酶,利用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解金槍魚粉的工藝,得到最優(yōu)酶解條件為:料液比1∶5 (g∶mL)、加酶量為1×104U·g-1金槍魚粉、酶解溫度55 ℃、酶解液pH為10.5、酶解時(shí)間8 h,此條件下水解度為29.20%±0.08%。

對(duì)金槍魚魚粉酶解液的功能性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),酶解液具有較好的抗氧化性,對(duì)·OH自由基的清除率、對(duì)酪氨酸酶的抑制率均隨氨基酸態(tài)氮濃度的增加而增大;當(dāng)氨基態(tài)氮濃度為7.57 mg·mL-1時(shí),其總還原力與0.4 mg·mL-1維生素C接近;酶解液對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用,在一定濃度范圍內(nèi)抑菌效果隨氨基態(tài)氮濃度增加而升高。

后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)金槍魚酶解液中多肽進(jìn)行分離純化研究,為從金槍魚粉酶解液中尋找具有抗氧化功能活性的活性多肽提供物質(zhì)基礎(chǔ)。