微生物基因工程與農業(yè)產業(yè)化發(fā)展探究

邱小忠 楊罡 陳俊 黃國昌 龔小華 連晨姿

摘 要 微生物可以用于提高農業(yè)生產效益，基于此，介紹和探討飼料用植酸酶、固氮微生物肥料以及微生物農藥的研究與開發(fā)，如微生物農藥中細菌殺蟲劑、真菌殺蟲劑、病毒殺蟲劑和殺蟲抗生素等的最新研究進展。同時，建議加強微生物基因工程的基礎研究，明確確定研究重點，為后續(xù)革新生產工藝，調整研發(fā)結構，促進產業(yè)發(fā)展奠定基礎。

關鍵詞 微生物;基因工程;農業(yè)產業(yè)化

中圖分類號：F323.3 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.32.075

微生物與人類的關系十分密切，人們生活中的酒、面包、酸奶、抗生素和疫苗等都來源于微生物發(fā)酵。但與此同時，有害微生物也可能導致嚴重災難，如黑死病、新冠病毒等。由于微生物的諸多作用，人們開始探索微生物作用于提高農業(yè)生產經(jīng)濟效益的各種可能，并結合基因工程放大這種效益和成果。

1 飼料用植酸酶的產業(yè)化

在動物腸道中，微生物起著促進消化的作用，控制禽畜腸道微生物平衡、改善禽畜腸道微生物種類能夠使得被禽畜攝入的食物更快速地分解，有助于禽畜消化吸收食物中各種營養(yǎng)成分。植酸酶是可以由微生物產生并幫助禽畜消化吸收植酸磷的一種助劑，其不僅有著減少禽畜糞便磷污染的作用，還能夠促進禽畜吸收分解后的無機磷，減少飼料中磷酸氫鈣的使用，促使禽畜更好更快地生長。中國農業(yè)科學院飼料研究所結合微生物基因工程技術修飾改造了植酸酶基因phAc，研究出了高產植酸酶的畢赤酵母，重組后的畢赤酵母植酸酶產量是原始菌株的3 000倍[1]。該成果已經(jīng)應用于禽畜養(yǎng)殖領域，年產植酸酶已經(jīng)超過20萬噸，利潤高達17.35億元。飼料用植酸酶產業(yè)化已經(jīng)相對成熟，生產出的植酸酶在各個省市都有供應。

2 固氮微生物肥料的產業(yè)化

氮元素是植物生長并合成蛋白質不可或缺的必要元素，在植物種植領域，尿素的使用極大地提高了農作物產量，但尿素生產也會產生很大污染，且尿素生產成本較高，價格波動較大，減少尿素等化肥的使用一直是農業(yè)生產所追求方向。由于土壤中植物根系附近共生著許多固氮微生物，在非豆類植物固氮方面存在較大的研究價值。如北京大學等針對對固氮斯氏假單胞菌進行基因工程層面的研究，通過構建攜帶固氮擠壓和耐銨基因的菌株實現(xiàn)了菌株固氮作用的提高，并在種植領域廣泛應用[2]。該應用最先在遼寧省推廣，使得遼寧省部分植物氮肥使用減少了15%，并增產10%以上。聯(lián)合固氮微生物雖然比不上自身固氮微生物固氮效率高，但其還會產生吲哚乙酸、維生素、赤霉素、氨基酸等營養(yǎng)物質，同樣具有促進植物生長發(fā)育的作用。

固氮菌肥料的生產應嚴格按照微生物要求在設備完善的工廠生產，通過原始生產菌種、一級擴大斜面菌種、二級擴大液體菌種、種子罐、發(fā)酵罐和分裝出廠等流程完成生產工序。生產的固氮菌肥料主要有3種劑型：1）液體劑型，該劑型生產使用均十分便利，但在高溫條件下菌株數(shù)量下降較快，適合隨產隨用，一般面向工廠周邊的農業(yè)生產;2）固體劑型，一般以草炭等作為吸附劑載體，由于載體中含有大量有利于固氮菌生產的有機質，固體劑型中固氮菌還能再繁殖，適用于更遠地區(qū)使用;3）凍干制劑型，凍干制劑通常是將發(fā)酵制成的菌液通過低溫真空凍干技術制造成型，每瓶制劑可含活菌200億個以上，該方法生產的制劑通過冷凍保存可以擁有更長的保質期，但生產成本更高。

除了固氮菌外，還有很多有助于植物生長的細菌，如醋桿菌、枯草桿菌、巨大芽孢桿菌等，并衍生出植物根際促生菌肥，如熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌能產生類赤霉素物質以及吲哚乙酸，還有些植物根際促生菌有抑制鐮刀菌、腐霉菌等病菌的作用。這些植物根際促生菌與其他微生物肥料共同使用效果往往更好，但也需要注意是否會產生拮抗作用。

3 微生物農藥的研究與開發(fā)

3.1 細菌殺蟲劑

農藥是農業(yè)中用于消滅病蟲害、保證農作物正常生長的制劑，但農藥不僅對害蟲有效也可能因為食用而作用于人體，因此農藥的使用開始被限制。在農藥使用受限的背景下，研發(fā)對人體無害的非化學農藥，微生物農藥就是在這背景下產生的。微生物農藥可分為兩種，分別是利用微生物活體制成的農藥和利用微生物的代謝產物制成的農藥;亦可以根據(jù)用途劃分為殺蟲劑、殺菌劑以及除草劑。專門寄生于昆蟲的病原菌有日本緊箍咒芽孢桿菌、緩死芽孢桿菌等，可誘發(fā)金龜子幼蟲發(fā)生乳狀病，但這些菌種只在幼蟲體內生長，培養(yǎng)難度較大。常用的芽孢桿菌主要是產伴孢晶體昆蟲病原菌——蘇云金芽孢桿菌，該昆蟲病原菌對鱗翅目、直翅目、毛翅目等超過600種昆蟲有致病作用，在殺蟲領域被廣泛使用和研究。在此基礎上，華中農業(yè)大學、中山大學等獨立發(fā)現(xiàn)了蘇云金芽孢桿菌超過35個新基因型，并將超過10種的蘇云金芽孢桿菌應用于棉花、蔬菜等的病蟲害防治，如WG001就是我國首個成功商業(yè)化的蘇云金芽孢桿菌菌劑[3]。蘇云金芽孢桿菌制劑通常是通過人工生產培養(yǎng)后獲取芽孢、伴孢晶體等有效殺蟲毒素，然后制作成殺蟲菌劑，生產方法有液體深層通氣發(fā)酵法和固體發(fā)酵法兩種，制劑類型有粉劑、顆粒劑和懸浮劑等多種。

3.2 真菌殺蟲劑

除蘇云金芽孢桿菌制作而成的細菌殺蟲劑外，部分真菌同樣具有殺蟲效力。當前已知的以昆蟲為寄主的真菌超過750種，涉及昆蟲超過200種，如蟲草菌是殺死昆蟲產生冬蟲夏草的一種真菌。但冬蟲夏草生長周期較長，并不適合作為殺蟲菌劑使用。關于殺蟲真菌方面，相關研究較多主要為白僵菌和綠僵菌。白僵菌主要以分生孢子作為侵染手段，當分生孢子附著于昆蟲體壁上時，在濕潤條件下萌發(fā)孢子的芽管可以穿透昆蟲體壁吸收營養(yǎng)并在昆蟲血腔中大量繁殖，最終導致昆蟲死亡。白僵菌常用于玉米螟蟲和松毛蟲的防治。在我國開始大量種植玉米后，關于白僵菌的研究主要方向轉為研制對玉米螟蟲毒性更高的白僵菌。如吉林省農科院研制出Mad1基因球孢白僵菌工程菌株，通過克隆來源于生防真菌綠僵菌的黏著蛋白基因Mad1結合PEG介導原生質體轉化法最終獲得了轉Mad1基因球孢白僵菌[4]。轉Mad1基因球孢白僵菌對亞洲玉米螟幼蟲致死時間縮短34.07%，具有較高的實用價值。白僵菌培養(yǎng)較為容易，通過麥麩、玉米粉等制半固體培養(yǎng)基即可培養(yǎng)得分芽孢，將培養(yǎng)物干燥即可得到白僵菌粉劑。

3.3 病毒殺蟲劑

除細菌真菌外，病毒也可作為殺蟲劑使用。當前已知能夠作用于昆蟲的病毒超過1 600種，其中研究和使用較多的是核多角體病毒（Nuclear Polyhedrosis Viruses，簡稱NPV），NPV病毒的特點是宿主特異高，殺蟲范圍窄，但不影響天敵也無污染，主要傳播手段為宿主的繁殖行為，殺蟲時間較長且適用蟲譜較窄。關于NPV病毒的研究有很多，如薛貴收等對野生型斜紋夜蛾核型多角體病毒（SpltMNPV）日本株進行了改造，通過缺失polh或egt基因并插入由多角體啟動子pph啟動外源毒素蝎毒素基因，獲得了殺蟲效力更高的重組病毒[5]。由于NPV病毒生產不如細菌真菌便捷，且適用范圍較窄，NPV商業(yè)化成功的案例還較少。

3.4 殺蟲抗生素

殺蟲抗生素也是常見的殺蟲產品，殺蟲抗生素主要由微生物次級代謝物為主要成分，這些次級代謝物對部分昆蟲有毒害作用。殺蟲抗生素種類很多，如抗霉素、殺蝶素、尼可霉素、殺螨素和密爾比菌素等?？姑顾貙ο夘?、蜘蛛等毒性很高，還有抑制真菌生長的作用，但由于其對人體同樣有較高傷害因此未被廣泛使用。當前廣泛使用的殺蟲抗生素主要是阿維菌素，其有阿維鏈霉菌產生，對線蟲、節(jié)肢動物以及螨類都有非常高的殺蟲活性。作用機理為抑制無脊椎動物的γ-氨基丁酸的激活劑使昆蟲神經(jīng)麻痹并最終死亡。浙江海正藥業(yè)股份有限公司通過的破壞除蟲鏈霉菌ave D基因，提高阿維菌素B1a的發(fā)酵單位，使得阿維菌素單位發(fā)酵產量提高了33.6%[6]。另外，多殺菌素也是一種重要的殺蟲抗生素，其對小菜蛾、棉鈴蟲等常見害蟲菌有效，適用于上百種農作物。關于多殺菌素的基因工程研究以提高多殺菌素產量為主，如黃穎等針對基于組學分析開展了構建多殺菌素高產基因工程菌及其代謝調控的研究[7]。

除了殺蟲以外，微生物也可用于殺菌，如引起冠癭病的土壤桿菌可以由放射土壤桿菌的拮抗作用來治理;木霉菌可以用于鐮刀菌病害防治等。微生物殺菌同樣可以以農藥抗生素的方式進行，如井岡霉素、公主嶺霉素等都是較好的殺菌抗生素。

4 微生物基因工程農業(yè)產業(yè)化發(fā)展建議

4.1 加強基礎研究

關于微生物基因工程的研究一直在穩(wěn)步推進，但大部分是對已有微生物已知基因功能的挖掘和利用，在DNA蛋白質層面的研究嚴重不足?？茖W家至今也只清楚部分DNA產生蛋白質后的作用，對于大部分微生物其他DNA的作用并不十分清楚。加強基礎研究有助于更全面地了解微生物，更好地將微生物應用于生產生活的各個領域，并提高人們對細胞微生物等的了解。應加強農業(yè)微生物結構基因組和功能基因組學研究，加強微生物在除草、堆肥、沼氣發(fā)酵、污水處理、土壤處理等領域的應用和研究，促使微生物研究與實用場景結合。

4.2 確定研究重點

多年來，人們高度重視對細菌真菌這兩大種類微生物的研究，卻忽視了病毒在微生物領域的特殊作用。事實上，SARS病毒、H5N1禽流感病毒、豬流感病毒乃至現(xiàn)在的新冠病毒多次給人類帶來慘痛損失，關于病毒的研究卻總是停留在測序、疫苗研制等有限領域，可見關于病毒的研究亟待加強。應重點關注病毒與細胞結合的特殊功能，探索病毒修復目標細胞基因缺陷的可能，探索通過病毒運輸靶向藥的可能，探索病毒為人類身體健康服務，為農業(yè)生產服務的可能。

4.3 革新生產工藝

當前，農業(yè)微生物產品主要以液態(tài)制劑、固態(tài)制劑以及凍干制劑3種，前兩者雖然生產較為方便但都有較大的保存限制。革新生產工藝有助于微生物產品的保存和更廣泛的應用，降低微生物產品的使用門檻，提高微生物基因工程研究的經(jīng)濟效益，革新生產工藝應以加速微生物培養(yǎng)以及提高產品純度為主要研究方向。

4.4 調整研發(fā)結構

產學研一體化是值得借鑒的科研體系，引入企業(yè)的力量不僅有助于高校研究方向的確立，也有助于提高高?？蒲匈Y金和實力。應盡可能多地與企業(yè)合作，如與生豬養(yǎng)殖企業(yè)合作研制非洲豬瘟病毒疫苗等，相關研究一旦有研究成果可以快速落地，加速科研成果產業(yè)化的落地速度。

5 結語

微生物產業(yè)化發(fā)展還有很多路要走，雖然在關于病蟲害防治方面的研究已經(jīng)有很多，但對于微生物在除草、土壤治理、污水處理等方面的研究依然不足。微生物研究也需要產學研一體化發(fā)展，提高研究的應用價值和產業(yè)配套速度，以更好地體現(xiàn)微生物研究的應用價值。

參考文獻：

[1] 崔帥，王作平，于江輝，等.轉植酸酶-抗菌肽融合基因水稻BPL9K的植酸酶活性分析[J].分子植物育種，2019，17（10）：3332-3339.

[2] 劉劍君，王豹祥，張朝輝，等.一株具有固氮功能的煙草根際微生物的鑒定及其初步效應[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2011，17（5）：1237-1242.

[3] 陸宴輝，趙紫華，蔡曉明，等.我國農業(yè)害蟲綜合防治研究進展[J].應用昆蟲學報，2017，54（3）：349-363.

[4] 趙宇，張佳詩，劉艷微，等.創(chuàng)制轉Mad1基因球孢白僵菌工程菌株提高對玉米螟毒力[J].玉米科學，2019，27（5）：39-44，51.

[5] 薛貴收，肖娛玉，朱江，等.昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究與應用進展[J].江蘇農業(yè)科學，2009（2）：8-11.

[6] 李美紅，李娜，王海彬，等.aveD基因失活提高阿維菌素工業(yè)菌株B組分產量[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2014，35（5）：216-218，254.

[7] 黃穎，趙晨，楊博磊，等.刺糖多孢菌高產菌株和野生型菌株多殺菌素生物合成基因簇（spn）在發(fā)酵過程中的表達分析[J].農業(yè)生物技術學報，2014，22（11）：1337-1346.

（責任編輯：趙中正）