CXCL13激活A(yù)kt促進肺癌放療抵抗

耿閃閃 ，何翠*，陳春麗，鄧鑫州，邱力，柯青，吳林，段奇文，施明亮，駱志國

0 引言

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高居惡性腫瘤的首位，5年生存率仍不足20%[1-2]。放療是肺癌治療的主要手段之一[3]，然而放療抵抗是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[4]。因此探尋肺癌放療抵抗的新靶標(biāo)及其潛在分子機制有著重要意義。

趨化因子是一類由炎性細胞和組織細胞產(chǎn)生并分泌、使細胞定向移動的小分子分泌蛋白。CXCL13又稱B細胞趨化因子1（B cell lymphocyte chemoattractant,BLC1），是趨化因子CXC家族的一員，主要分布在胃、肝臟和淋巴結(jié)中[5]。CXCR5又稱伯基特淋巴瘤受體1（Burkitt’s lymphoma receptor 1,BLR-1），是CXCL13的受體，參與循環(huán)中幼稚B淋巴細胞歸巢及淋巴結(jié)發(fā)育構(gòu)建等過程[6]。近年研究顯示，CXCL13/CXCR5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)CXCL13/CXCR5通過激活A(yù)kt通路促進腎細胞癌進展[7]，還可以通過激活JNK信號通路介導(dǎo)前列腺癌細胞增殖[8]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子可影響癌細胞對放療的敏感度[9-10]。目前，國內(nèi)外尚未見CXCL13/CXCR5與肺癌放療敏感度關(guān)系研究的報道。

本研究通過生物信息學(xué)手段和細胞學(xué)實驗探討CXCL13與肺癌放療敏感度的關(guān)系及Akt在CXCL13介導(dǎo)的肺癌放療抵抗中的作用，以期為臨床解決肺癌放射抵抗問題提供新的作用靶標(biāo)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；重組人CXCL13（貨號250-24）購自美國PeproTech公司；Akt抑制劑LY294002（貨號154447-36-6）購自美國Selleck公司。蛋白裂解液、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自南通碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人GAPDH抗體（貨號ab8245）、鼠抗人Akt（貨號ab8805）、鼠抗人p-Akt（ser473）（貨號ab32370）抗體及山羊抗鼠HRP-標(biāo)記二抗（貨號ab6721）購自Abcam公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人肺腺癌H1975細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、置于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 GEO公共數(shù)據(jù)庫分析CXCL13和CXCR5在肺癌中的表達水平 在PubMed主界面（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）搜索欄中找到GEO datasets選項，進入GEO數(shù)據(jù)庫，在搜索框中輸入檢索關(guān)鍵詞“ lung cancer”，篩選條件設(shè)置為“Homo sapiens”，找到有臨床信息、正常組、腫瘤組及最大樣本量的數(shù)據(jù)集GSE30219，下載series_matrix文件及平臺文件GPL570，解析出每條探針對應(yīng)的基因名。將樣本歸納為正常組、肺腺癌組、肺鱗癌組、基底樣細胞肺癌組、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌組和小細胞肺癌組，用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 Kaplan Meier-plotter公共數(shù)據(jù)庫分析CXCL13和CXCR5表達水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系 進入Kaplan Meier-plotter [Lung Cancer]欄目（網(wǎng)址http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung），輸入基因名稱后，在Survival窗口分別選擇總生存期（OS）、無進展生存期（FP）和進展后生存期（PPS），在Radiotherapy窗口選擇yes，點擊Draw Kaplan Meier-plotter，獲取生存曲線。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 用不同濃度的CXCL13或LY294002處理細胞為實驗組，以DMSO處理細胞為陰性對照組。收集細胞（約1×106個），按照試劑盒說明書操作提取蛋白，BCA法進行蛋白定量。取20 μg總蛋白用10% SDS-PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗5次×3 min，二抗室溫孵育2 h，TBST漂洗5次×3 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以ImagePro Plus 6.0圖像分析軟件計算灰度值，將內(nèi)參蛋白與目的蛋白兩者灰度值的比值作為目的蛋白的表達量。

1.2.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖 將細胞用CXCL13或LY294002處理為實驗組，以DMSO處理細胞為陰性對照組，用8 Gy X線照射，收集細胞（約1×106個），以每孔3 000個細胞鋪到96孔板中，培養(yǎng)24、48、72、96 h后分別向?qū)?yīng)的細胞中加入CCK-8，將96孔培養(yǎng)板置于恒溫箱孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將細胞用CXCL13或LY294002處理，DMSO處理組作為陰性對照組，用8 Gy X線照射，收集細胞（約1×106個），預(yù)冷PBS洗3次。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用Annexin V/PI雙染，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 細胞克隆形成實驗 細胞經(jīng)消化計數(shù)后，收集細胞鋪到6孔板中，每孔500個細胞。每組3孔平行樣本。用相應(yīng)濃度的CXCL13和（或）LY294002預(yù)處理，并用0或8 Gy X線照射后，靜置于37℃溫箱中培養(yǎng)14天。14天后培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，用PBS輕輕沖洗2～3遍，1%結(jié)晶紫染色20 min，除去染色液，純水輕輕洗滌2～3遍，晾干，相機拍照留底，顯微鏡下計數(shù)克隆個數(shù)，≥50個細胞的細胞團作為一個克隆。

以上所有實驗至少重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 6.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)結(jié)果以（）表示，通過雙側(cè)Student’st檢驗及配對樣本t檢驗進行計算分析，應(yīng)用χ2檢驗和單因素方差分析進行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13和CXCR5在肺癌組織中的表達

以GEO公共數(shù)據(jù)庫臨床資料較為全面的數(shù)據(jù)集GSE30219為分析對象，分析正常組織、肺腺癌組織、肺鱗癌組織、基底樣細胞肺癌組織、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌組織和小細胞肺癌組織的CXCL13和CXCR5的表達（Log值）差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCL13表達水平與肺癌臨床分期密切相關(guān)（P=0.037），CXCL13和CXCR5表達水平與肺癌病理類型密切相關(guān)（PCXCL13=0.012,PCXCR5=0.001），二者表達水平與年齡和性別無顯著相關(guān)性，見表1。肺腺癌組織、肺鱗癌組織、基底樣細胞肺癌組織、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞肺癌的CXCL13表達水平顯著高于正常組織（P＜0.001），見圖1A。肺腺癌組織、肺鱗癌組織和基底樣細胞肺癌組織的CXCR5表達水平顯著高于正常組織（P＜0.001），而肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞肺癌的CXCR5表達水平與正常組織相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1B。上述結(jié)果提示CXCL13和CXCR5可能與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。

2.2 CXCL13高表達與肺癌放療患者不良進展后生存期（post progression survival,PPS）密切相關(guān)

CXCL13的表達水平與肺癌的OS（HR=1.07,P=0.80）、PFS 無顯著相關(guān)性（H R=0.67,P=0.15）；CXCL13的高表達與肺癌的不良PPS密切相關(guān)（HR=1.87,P=0.04），分別見圖2A、2C、2E。CXCR5的表達水平與肺癌的OS（HR=0.04,P=0.89）、PFS（HR=1.43,P=0.19）、PPS均無顯著相關(guān)性（HR=1.16,P=0.61），分別見圖2B、2D、2F。上述結(jié)果提示CXCL13的表達水平可能與肺癌進展后的放療敏感度存在相關(guān)性。

2.3 CXCL13促進H1975細胞輻射抵抗

表1 CXC13和CXCR5表達和臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 (例)Table 1 Relation between CXC13/CXCR5 expression and clinicopathological characteristics of lung cancer patients (n)

圖1 利用GEO數(shù)據(jù)集GSE30219分析CXCL13(A)和CXCR5(B)在肺癌組織中的表達水平Figure 1 Expression levels of CXCL13(A) and CXCR5(B)in lung cancer tissues analyzed by GEO data set GSE30219

用0、10、50、100 ng∕ml的CXCL13處理人非小細胞肺癌H1975細胞，以DMSO處理細胞為陰性對照組，經(jīng)8 Gy X線照射后，100 ng∕ml CXCL13處理組細胞增殖水平顯著高于對照組（P=0.015,F=0.381），見圖3A。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：隨著CXCL13濃度的提高，H1975細胞的凋亡率呈逐漸下降，其中100 ng∕ml CXCL13處理組細胞凋亡率顯著低于對照組（P=0.001,F=0.666），見圖3B。50和100 ng∕ml CXCL13處理組細胞克隆形成能力顯著高于對照組（P50=0.049、F50=1.000,P100=0.014、F100=0.464），見圖3C。上述結(jié)果提示CXCL13可增強H1975細胞輻射抵抗。

2.4 CXCL13促進Akt磷酸化

Western blot檢測0、10、50、100 ng∕ml的CXCL13處理H1975細胞后的Akt表達及磷酸化水平，結(jié)果顯示：100 ng∕ml的CXCL13顯著促進H1975細胞Akt的磷酸化（F=0.194,P=0.005），但不促進其表達，見圖4。

2.5 CXCL13通過激活A(yù)kt介導(dǎo)H1975細胞輻射抵抗

用Akt抑制劑LY294002來阻斷Akt的活化，結(jié)果顯示：與對照組相比，10、20 μg∕ml LY294002（以下簡稱LY）可顯著抑制Akt活化（P10=0.042、F10=0.400,P20=0.009、F20=0.362），見圖5A。細胞增殖結(jié)果顯示：經(jīng)8 Gy X射線處理，CXCL13處理組細胞的增殖能力顯著高于對照組（P=0.022,F=0.415）；而CXCL13+LY處理組與CXCL13單獨處理組相比，細胞增殖能力顯著下降（P=0.019,F=0.178），見圖5B。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示：經(jīng)8 Gy X射線處理，CXCL13處理組細胞的凋亡水平顯著低于對照組（P=0.004,F=1.000）；而CXCL13+LY處理組與CXCL13單獨處理組相比，細胞凋亡水平顯著升高（P=0.003,F=0.918），見圖5C。經(jīng)8 Gy X射線處理，CXCL13處理組細胞克隆形成能力顯著高于對照組（P=0.005,F=0.490）；而CXCL13+LY處理組與CXCL13單獨處理組相比，克隆形成能力顯著降低（P=0.001,F=0.400），見圖5D。上述結(jié)果提示Akt參與了CXCL13介導(dǎo)的H1975細胞輻射抵抗。

圖2 CXCL13和CXCR5表達水平與肺癌放療患者預(yù)后關(guān)系Figure 2 Relation between CXCL13/CXCR5 expression levels and prognosis of lung cancer patients who received radiotherapy

圖3 CCK-8、流式細胞術(shù)和克隆形成實驗檢測8Gy X射線和不同濃度的CXCL13對肺癌細胞H1975增殖(A)、凋亡(B)和克隆形成能力(C)的影響Figure 3 Effects of 8Gy X-ray and different concentrations of CXCL13 on proliferation,apoptosis and clone formation abilities of lung cancer H1975 cells detected by CCK8 method,flow cytometry and clone formation assay

圖4 Western blot檢測不同濃度CXCL13處理H1975細胞30 min后Akt的表達及活化水平Figure 4 Expression and activation levels of Akt in H1975 cells after CXCL13 treatment at different concentrations for 30 min detected by Western blot

3 討論

放療抵抗的機制十分復(fù)雜，大量報道證實放療抵抗的發(fā)生與細胞周期阻滯、相關(guān)基因改變、腫瘤微環(huán)境變化、自噬性調(diào)節(jié)及腫瘤干細胞的存在等多種因素相關(guān)[11]。研究放療抵抗機制，尋找放療抵抗新靶標(biāo)是提高放療療效的關(guān)鍵，同時也將為腫瘤放療敏感度的預(yù)測提供可能。

趨化因子及其受體在調(diào)節(jié)血管生成、細胞遷移及機體發(fā)育過程發(fā)揮重要作用。近些年研究發(fā)現(xiàn)趨化因子及其受體在腫瘤治療抵抗中也發(fā)揮重要作用[12]。研究顯示CXCL12/CXCR4高表達與頭頸腫瘤放化療抵抗密切相關(guān)[13]。腫瘤相關(guān)成纖維細胞分泌的CXCL1顯著增強食管鱗狀細胞癌放射抵抗能力[14]。靶向CXCL12/CXCR4通路可顯著增強進展后宮頸癌的放療效果[15]。研究顯示，CCR6的表達水平與腎癌放療敏感度呈負相關(guān)[16]。Zhou等研究證實用CXCR4拮抗劑AMD3100可顯著增強三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231的放射敏感度[17]。目前，CXCL13和CXCR5與腫瘤治療抵抗的研究比較少見。僅有Jiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)CXCR5高表達與乳腺癌的放化療抵抗密切相關(guān)。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CXCL13和CXCR5在肺癌組織中高表達，且CXCL13高表達與肺癌進展后生存期密切相關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)CXCL13可顯著增強肺癌細胞株H1975放射處理后細胞增殖能力和克隆形成能力，降低凋亡水平，提示CXCL13可增強肺癌放療抵抗。Singh等[19]研究結(jié)果也表明CXCL13和CXCR5在非小細胞肺癌中高表達，但其只檢測了肺腺癌和肺鱗癌標(biāo)本，而本研究分析了肺腺癌、肺鱗癌、基底樣細胞肺癌、肺大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和小細胞肺癌的CXCL13/CXCR5表達水平,發(fā)現(xiàn)其在肺腺癌、肺鱗癌和基底樣細胞肺癌組織的表達水平顯著高于正常組織，提示CXCL13和CXCR5可能與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。

圖5 Akt對CXCL13介導(dǎo)的肺癌細胞輻射抵抗的影響Figure 5 Effect of Akt on CXCL13-mediated radioresistance of lung cancer cells

研究顯示，Akt促進腫瘤的增殖、遷移及抗凋亡，其可被多種趨化因子激活，隨著研究的深入，Akt在腫瘤放療抵抗中的重要作用也被不斷證實[20-21]。Che等[22]研究證實，PI3K/Akt參與TRIP4介導(dǎo)的宮頸癌放療抵抗。另有研究顯示，抑制PI3K/Akt和MAPK信號通路可顯著增強腎癌的放射敏感度[7]。關(guān)于CXCL13/CXCR5與Akt的關(guān)系也有相關(guān)研究報道，研究發(fā)現(xiàn)CXCL13/CXCR5可激活A(yù)kt促進結(jié)腸癌細胞增殖和侵襲[23]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，CXCR5在乳腺癌細胞中調(diào)控PI3K/Akt通路[18]。目前，CXCL13/CXCR5-Akt通路與腫瘤放射敏感度的研究尚未見報道。鑒于Akt在放射抵抗中的作用，我們推測Akt可能參與了CXCL13介導(dǎo)的肺癌細胞放射抵抗，本研究結(jié)果顯示，CXCL13可促進肺癌細胞H1975 Akt活化，抑制Akt顯著降低CXCL13介導(dǎo)的H1975細胞放射抵抗。然而本研究也存在一些不足之處，未闡明CXCL13到底是通過激活A(yù)kt下游哪些分子參與肺癌放療抵抗，而CXCL13促進肺癌細胞放射抵抗的信號通路也很可能不止Akt一條，這些機制都值得后續(xù)進一步探討。

綜上所述，本研究探討了CXCL13在肺癌的表達水平，初步證實CXCL13促進肺癌細胞放射抵抗，其可能的機制是CXCL13通過活化Akt來實現(xiàn)的。本研究有望為解決臨床肺癌放療抵抗問題提供一個新的治療靶標(biāo)。