基于RNA-seq 數(shù)據(jù)的栽培種花生SSR 位點(diǎn)鑒定和標(biāo)記開(kāi)發(fā)

徐志軍，趙勝，徐磊，胡小文，安東升，劉洋

（1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站/廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研發(fā)中心，廣東湛江 524013；；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120）

0 引言

【研究意義】栽培種花生（Arachis hypogaea）是中國(guó)主要的油料與經(jīng)濟(jì)作物之一，在保證中國(guó)食用油和植物蛋白供給、促進(jìn)農(nóng)民增收方面具有重要作用。伴隨花生基因組學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，大量基于分子標(biāo)記的花生品種鑒定[1-2]、種質(zhì)資源遺傳多樣性[3-5]、重要性狀的QTL 定位[6-9]、基因挖掘和育種研究[10-14]得以開(kāi)展。然而，由于花生遺傳基礎(chǔ)狹窄，SSR 標(biāo)記多態(tài)性較低，基因組較大（約2.7 GB），且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)有的SSR 標(biāo)記，特別是用于高密度遺傳圖譜構(gòu)建和重要功能基因挖掘的標(biāo)記還較為缺乏，限制了花生重要功能基因的解析和應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，SSR 標(biāo)記因其分布廣泛、共顯性、多態(tài)性好、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于花生遺傳研究和育種實(shí)踐中。利用基因組文庫(kù)（如BAC 文庫(kù)）[15-24]、表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）文庫(kù)[25-32]、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[33-35]、全基因組數(shù)據(jù)[9,36-37]和近緣物種（如大豆）[38]中的SSR 序列進(jìn)行花生SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于花生的研究。任小平等[2]利用篩選到的60 對(duì)核心SSR 標(biāo)記構(gòu)建了100 份花生品種的指紋圖譜；張照華等[39]在高油酸育種中利用62 對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)10 個(gè)BC4F2特定基因型株系進(jìn)行遺傳背景評(píng)估，篩選出與親本中花16 最優(yōu)的近等基因系材料。除此之外，利用基于SSR 標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜和關(guān)聯(lián)圖譜，鑒定出與栽培種花重要農(nóng)藝性狀緊密連鎖的QTL，如株高等株型相關(guān)性狀[6,40-42]、莢果和種子相關(guān)性狀[7-8,43-44]、抗旱[45]、葉斑病等抗病性[46-47]。在水稻、大豆、玉米等作物上的研究還表明，功能基因中的特異性SSR 標(biāo)記（或緊密連鎖標(biāo)記）還可以用于分析基因的等位變異和功能變異[48-50]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，盡管一批栽培種花生重要性狀相關(guān)QTL 被鑒定出來(lái)，但是進(jìn)入育種應(yīng)用的還較少，最主要的原因是構(gòu)建的遺傳圖譜標(biāo)記密度還不夠高，鑒定的QTL 的遺傳距離還較大，標(biāo)記與基因間的連鎖還不夠緊密，在實(shí)際運(yùn)用中基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，有必要利用現(xiàn)有資源開(kāi)發(fā)更多SSR 標(biāo)記，對(duì)這些重要功能基因進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆。利用野生花生基因組，JOSH等[51]對(duì)栽培種花生全生育期中22 種不同類型的組織進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，組裝了栽培種花生的轉(zhuǎn)錄組圖譜，包含了花生正常生育條件下最多的基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)，這些轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)中包含了大量還未利用的SSR標(biāo)記資源，且來(lái)自轉(zhuǎn)錄組的SSR直接與功能基因的表達(dá)相關(guān)，是開(kāi)發(fā)功能基因特征標(biāo)記的潛在資源?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬利用已發(fā)表的栽培種花生RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定SSR 位點(diǎn)、開(kāi)發(fā)與基因相關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，進(jìn)一步豐富花生SSR 標(biāo)記，為花生重要功能基因的挖掘、等位變異研究和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.2 RNA-seq 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋信息，將組裝序列與基因名稱、染色體定位、基因功能等信息進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)。

1.3 SSR 位點(diǎn)挖掘及基因SSR 引物設(shè)計(jì)

使用MISA 軟件（microsatellite identification tool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索栽培種花生轉(zhuǎn)錄組unigene 中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，并對(duì)SSR 重復(fù)基序類型進(jìn)行特征分析。查找標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)魏塑账峄蛑辽僦貜?fù)次數(shù)為10，而2、3、4、5 和6 核苷酸基序最少重復(fù)次數(shù)分別為6、5、5、5 和5。

使用Primer3.0 軟件對(duì)SSR 位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，每個(gè)SSR 位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)3 組引物，并且滿足以下的特征：（1）長(zhǎng)度在15—25 bp；（2）PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100—400 bp；（3）退火溫度（Tm 值）在50℃—60℃；（4）GC 的含量在40%—60%；（5）避免出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)及引物二聚體。

1.4 e-PCR 引物質(zhì)量檢測(cè)

使用e-PCR Version: 2.3.9 對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行電子PCR 檢測(cè)，參數(shù)設(shè)置按照DENG 等[52]方法進(jìn)行。分別分析來(lái)源于栽培種花生轉(zhuǎn)錄組的 SSR 引物在A.duranensis、A.ipaensis和栽培種花生（Tifrunner）全基因組（https://peanutbase.org/）中的擴(kuò)增情況，統(tǒng)計(jì)并記錄引物在基因組上的擴(kuò)增次數(shù)，剔除擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度小于100 bp 或大于500 bp 及特異性不好的引物。使用Tbtools[53]軟件對(duì)擴(kuò)增位點(diǎn)在基因組上的位置進(jìn)行 可視化。

1.5 花生DNA 提取及PCR 檢測(cè)

選取花生幼嫩葉片，采用改良CTAB 法提取DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 濃度與純度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?8 對(duì)隨機(jī)選取的基因SSR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（電子附表1）。PCR 反應(yīng)體系和PCR 程序按照HUANG等[6]方法進(jìn)行。

表1 栽培種花生RNA-seq SSR 位點(diǎn)分布特征Table 1 Distribution of RNA-seq SSR locus characteristics in cultivated peanut

2 結(jié)果

2.1 栽培種花生RNA-seq SSR 位點(diǎn)分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

栽培種花生22 個(gè)組織RNA-seq 深度測(cè)序共組裝獲得52 280 條轉(zhuǎn)錄本（總長(zhǎng)度75 821 219 bp），其中33 293 條轉(zhuǎn)錄本注釋到相應(yīng)基因（注釋到A 基因組16 222 個(gè)基因，B 基因組17 071 個(gè)基因）。利用MISA軟件從全部轉(zhuǎn)錄本中共鑒定出19 143 個(gè)SSR 位點(diǎn)，其中有1 494 個(gè)SSR 位點(diǎn)以復(fù)合位點(diǎn)的形式存在。在全部轉(zhuǎn)錄本中共有14 084 條轉(zhuǎn)錄本含有SSR 位點(diǎn)，發(fā)生頻率為26.94%，平均每3.96 kb 出現(xiàn)一個(gè)SSR；3 606條（6.90%）轉(zhuǎn)錄本中含有≥2 個(gè)SSR 位點(diǎn)，大部分轉(zhuǎn)錄本含有2—4 個(gè)位點(diǎn)，單條轉(zhuǎn)錄本中最多含7 個(gè)SSR 位點(diǎn)。在所有鑒定的SSR 位點(diǎn)中，大部分SSR位點(diǎn)分布于轉(zhuǎn)錄本序列5′端300 bp 或3′端300 bp 的區(qū)域，包括UTR、內(nèi)含子和CDS 區(qū)域。

栽培種花生轉(zhuǎn)錄組重復(fù)單元類型豐富，單核苷酸到五核苷酸均存在，各重復(fù)單元組成的SSR 數(shù)量上存在著較大差異（表1）。其中以單核苷酸和三核苷酸為重復(fù)單元的SSR 位點(diǎn)數(shù)最多，分別占SSR 位點(diǎn)總數(shù)的39.24%和38.40%，分布頻率為14.37%和14.06%，其中以五核苷酸為重復(fù)單元的SSR 位點(diǎn)數(shù)最少，僅為48 個(gè)。在SSR 位點(diǎn)基序種類方面，不同重復(fù)單元在基序種類上存在著豐富的多樣性，單核苷酸到五核苷酸基序種類分別為4、12、60、87 和39 種，共202 種，從單核苷酸到四核苷酸基序種類隨著重復(fù)單元堿基數(shù)增加而增加（表1）。

各重復(fù)單元優(yōu)勢(shì)基序類型隨著重復(fù)單元增加，在所屬重復(fù)單元SSR 位點(diǎn)中所占的比例呈下降趨勢(shì)（表1）。在鑒定出的SSR 位點(diǎn)中，單核苷酸重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)基序類型為A/T，為7 334 個(gè)，占所有以單核苷酸為重復(fù)單元的SSR 位點(diǎn)的97.62%；二核苷酸重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)基序類型為AG/CT，占該重復(fù)單元位點(diǎn)的72.01%；三核苷酸到五核苷酸重復(fù)單元中，優(yōu)勢(shì)基序類型依次為30.96%、24.59%和16.67%。

2.2 栽培種花生RNA-seq SSR 重復(fù)次數(shù)和基序長(zhǎng)度

鑒定的SSR 位點(diǎn)各重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)和SSR位點(diǎn)長(zhǎng)度存在著明顯的差異（表2 和圖1）。重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)為5—47（單核苷酸）次，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，同一重復(fù)單元類型的SSR位點(diǎn)數(shù)逐漸減少。其中，單核苷酸重復(fù)次數(shù)主要集中在10—12 次；二核苷酸重復(fù)次數(shù)主要集中在6—8 次；三核苷酸重復(fù)次數(shù)主要集中在5—6 次；四核苷酸和五核苷酸重復(fù)次數(shù)主要集中在5 次。從整體上看，重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)主要集中在5、6 和10 次，在所有SSR 位點(diǎn)中的分布頻率分別為24.24%、18.87%和17.37%。單個(gè)SSR 位點(diǎn)的長(zhǎng)度的分布范圍為10—47 bp，基序長(zhǎng)度主要集中在10—14 bp，其中，長(zhǎng)度為10 和12 bp 的基序數(shù)量最多，分別為2 985 和2 389 個(gè)；復(fù)合SSR 位點(diǎn)的長(zhǎng)度范圍為21—249 bp，其中，以長(zhǎng)度為31—40 bp 的復(fù)合位點(diǎn)最多，隨著基序長(zhǎng)度增加，復(fù)合SSR 位點(diǎn)數(shù)呈逐步減少的趨勢(shì)。

圖1 SSR 基序長(zhǎng)度分布Fig. 1 Distribution of SSR motif length

2.3 栽培種花生SSR 標(biāo)記的開(kāi)發(fā)

利用primer3.0 軟件，對(duì)14 084 條轉(zhuǎn)錄本中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)共有13 477 個(gè)SSR 位點(diǎn)可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其中，可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的單個(gè)SSR位點(diǎn)有12 515 個(gè)，復(fù)合SSR 位點(diǎn)962 個(gè)。不能進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的SSR 位點(diǎn)共4 172 個(gè)，其中，單個(gè)SSR 位點(diǎn)3 797 個(gè)，復(fù)合SSR 位點(diǎn)375 個(gè)；這些SSR 位點(diǎn)中共有1 771 個(gè)SSR 位點(diǎn)位于序列5′端50 bp 以內(nèi)，2 179個(gè)SSR 位點(diǎn)位于3′端100 bp 區(qū)域內(nèi)，SSR 位點(diǎn)位于序列起始端和末端，位點(diǎn)一端序列過(guò)短或無(wú)序列是造成這些位點(diǎn)不能進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的主要原因。在可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的序列中，共有5 661 條轉(zhuǎn)錄本未注釋到基因，這些序列中共包含7 305 個(gè)SSR 位點(diǎn)，有1 235條序列含有多個(gè)位點(diǎn)，單條序列最多含有7 個(gè)SSR 位點(diǎn)。

表2 栽培種花生SSR 各重復(fù)單元重復(fù)次數(shù)及分布頻率Table 2 Repetition times and distribution frequency of each SSR repeat unit in cultivated peanut

根據(jù)序列注釋信息，共有5 020 條轉(zhuǎn)錄本序列對(duì)應(yīng)到特定的基因，共包含5 859 個(gè)可進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的SSR 位點(diǎn)（單一位點(diǎn)和復(fù)合位點(diǎn)），基因的平均SSR位點(diǎn)密度為1.17（表3），共設(shè)計(jì)出17 574 對(duì)特定基因SSR 引物（每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3 對(duì)引物）。與基因?qū)?yīng)的SSR 位點(diǎn)在A 基因組和B 基因組共20 條染色體上不均勻分布（表3），其中B03 染色體上SSR 位點(diǎn)最多，為484 個(gè)；單一位點(diǎn)范圍為170（A02）—451（B03），共5 533 個(gè)；復(fù)合位點(diǎn)范圍為9（A01）—33（B03），共326 個(gè)。這些包含SSR 位點(diǎn)的基因主要以單位點(diǎn)基因的形式存在（68.75%），單條染色體基因數(shù)目為160（A07)—430（B03），其中單位點(diǎn)基因范圍為110（A07）—328（B03），多位點(diǎn)基因范圍為13（A02)—49（B04）。

2.5 e-PCR 引物質(zhì)量檢測(cè)分析

利用一組特定基因SSR 引物（5 859 對(duì)），分別以A.duranensis、A.ipaensis和栽培種花生基因組為模板進(jìn)行電子PCR。結(jié)果（表4）表明，栽培種花生特定基因SSR 引物在A.duranensis、A.ipaensis和栽培花生基因組中都具有較高的擴(kuò)增效率，在3 個(gè)基因組中的有效擴(kuò)增位點(diǎn)分別為4 468、4 929 和10 188 個(gè)，有效引物數(shù)分別為3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）對(duì)。且這些SSR 引物，在栽培種花生基因組中具有更高的多態(tài)性：在A.duranensis和A.ipaensis基因組中，引物擴(kuò)增位點(diǎn)主要以1 個(gè)位點(diǎn)為主，在有效引物中的比例分別為93.75%和91.33%；而在栽培種花生基因組中，SSR 引物擴(kuò)增位點(diǎn)主要以2 個(gè)位點(diǎn)為主（62.24%），其次是1 個(gè)位點(diǎn)（28.54%），且擴(kuò)增3 個(gè)及以上位點(diǎn)的SSR 引物數(shù)要顯著高于A.duranensis和A.ipaensis。在所有檢測(cè)的引物中，共有3 250（55.47%）對(duì)引物在3 個(gè)基因組中均可有效擴(kuò)增，716（12.22%）對(duì)可在A.duranensis和栽培種花生基因組中擴(kuò)增，978 對(duì)可在A.ipaensis和栽培種花生基因組中擴(kuò)增，231（3.94%）對(duì)僅在栽培種基因組中擴(kuò)增（圖2）。根據(jù)SSR 標(biāo)記在栽培種花生基因組中的擴(kuò)增情況和擴(kuò)增位點(diǎn)信息，繪制了SSR 位點(diǎn)物理圖譜（圖3）。根據(jù)QTL 兩端標(biāo)記在基因組上的位置，利用SSR 位點(diǎn)物理圖譜，可以為QTL 精細(xì)定位提供SSR 標(biāo)記信息。如圖4 所示，80 個(gè)基因關(guān)聯(lián)SSR 標(biāo)記可用于QTLqBWRB02.1的區(qū)間加密。

2.6 SSR 標(biāo)記擴(kuò)增及多態(tài)性分析

隨機(jī)合成了38 對(duì)SSR 引物在栽培種花生基因組中進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，在遠(yuǎn)雜9102 和花育910 基因組中共有35 對(duì)（92.1%）SSR 引物可以擴(kuò)增出清晰的條帶，其中有11 對(duì)（28.9%）SSR 引物在2 個(gè)品種間擴(kuò)增出差異條帶，有3 個(gè)SSR 標(biāo)記為顯性標(biāo)記，在2 個(gè)花生品種中表現(xiàn)為條帶有無(wú)的多態(tài)性（圖5）。表明開(kāi)發(fā)的基因關(guān)聯(lián)SSR引物在花生基因組中具有較高的擴(kuò)增效率和較好的多態(tài)性。

表3 可進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的特異基因SSR 位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistics of primer design specific gene-associated SSR

圖2 基因關(guān)聯(lián)SSR 標(biāo)記在基因組中的擴(kuò)增分布Fig. 2 Amplification site distribution of gene-associated SSR markers in peanut genome

圖3 花生SSR 標(biāo)記位點(diǎn)物理圖譜Fig. 3 Physical map of SSR markers in peanut genome

表4 基因關(guān)聯(lián)SSR 引物e-PCR 擴(kuò)增位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistics of gene-associated SSR primer amplified in peanut genome by e-PCR

圖4 花生青枯病抗性相關(guān)QTL 定位Fig. 4 QTL analysis of bacteria wilt resistance in peanut

圖5 隨機(jī)SSR 引物在花生品種遠(yuǎn)雜9102 和花育910 中的擴(kuò)增情況（部分）Fig. 5 Randomly SSR markers amplification in Yuanza 9102 and Huayu 910 (part)

3 討論

栽培種花生（2n=AABB）來(lái)源于數(shù)百萬(wàn)年前野生花生A.duranensis（2n=AA）和A. ipaensis（2n=BB）間的自然雜交、加倍事件，已有研究表明野生花生A基因組和B 基因組具有高度的共線性和一致性[54]。本研究開(kāi)發(fā)的基因關(guān)聯(lián)SSR 引物中，共有62.24%（3 221對(duì)）的有效引物具有2 個(gè)有效擴(kuò)增位點(diǎn)，且大部分引物擴(kuò)增的位點(diǎn)分別分布于栽培種花生A 基因組和B 基因組的同源染色體上，如引物A0101UKP-1-1 的2 個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，定位到A01 和B01 染色體上的一對(duì)等位基因Aradu.01UKP.1和Araip.K30076.1的基因序列上；且這些引物可以同時(shí)在野生花生A、B 基因組上有效擴(kuò)增。栽培種花生SSR 標(biāo)記的這些特性也進(jìn)一步印證了花生A、B 基因組的高度同源性。

SSR 標(biāo)記已廣泛的應(yīng)用于作物的遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、雜種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因挖掘和育種實(shí)踐中。來(lái)源于轉(zhuǎn)錄組的SSR 直接與功能基因的表達(dá)相關(guān)，鑒定轉(zhuǎn)錄組中與基因直接關(guān)聯(lián)的SSR 位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)與基因關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，對(duì)于研究基因的等位變異及變異對(duì)功能的影響、重要性狀關(guān)聯(lián)的基因挖掘和精細(xì)定位具有重要意義[55]。本研究鑒定了13 477 個(gè)可進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的SSR 位點(diǎn)，并對(duì)5 020 條基因轉(zhuǎn)錄本中5 859 個(gè)SSR 位點(diǎn)進(jìn)行了引物設(shè)計(jì)和電子PCR 檢測(cè)，進(jìn)一步豐富了花生SSR標(biāo)記，為基于分子標(biāo)記的花生研究提供了可利用的資源。其中有1 147 個(gè)基因關(guān)聯(lián)SSR 標(biāo)記e-PCR 檢測(cè)只有一個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，具有一定的特異性，這些SSR 標(biāo)記經(jīng)進(jìn)一步鑒定，有可能開(kāi)發(fā)成基因的特征標(biāo)記，應(yīng)用于基因在不同種質(zhì)中的等位變異研究和基因的功能變異研究。

當(dāng)前，盡管一批栽培種花生重要性狀相關(guān)QTL 被鑒定出來(lái)，為花生分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)；但實(shí)際上，進(jìn)入育種應(yīng)用分子標(biāo)記的還較少，最主要的原因是鑒定的QTL 的遺傳距離還較大，標(biāo)記與基因間的連鎖還不夠緊密，在實(shí)際運(yùn)用中存在目標(biāo)性狀丟失的風(fēng)險(xiǎn)[36]。利用SSR 位點(diǎn)物理圖譜和QTL 兩端標(biāo)記在基因上的位置，可以獲得對(duì)區(qū)間加密的SSR 標(biāo)記信息。作者前期利用花生抗、感青枯病親本遠(yuǎn)雜9102×徐州68-4 構(gòu)建的RIL 群體，在B02 連鎖群上鑒定出一個(gè)穩(wěn)定的QTLqBWRB02.1（或qBWRB02.4，標(biāo)記區(qū)間為AGGS1592-AHTE0775），表型變異解釋率為6.91%—18.68%[56]。根據(jù)標(biāo)記AGGS1592、GM2196（AHTE0775 相鄰連鎖標(biāo)記）在基因組上的位置信息，將qBWRB02.1定位于B02 染色體5.53 Mb 區(qū)域（包含402 個(gè)基因），根據(jù)SSR 位點(diǎn)物理圖譜，在此區(qū)間包含80 個(gè)基因關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記（圖4）。利用這些SSR標(biāo)記可對(duì)該位點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行加密，對(duì)花生青枯病抗性基因的進(jìn)行精細(xì)定位，從而大大減少候選基因的數(shù)量，為目的基因的圖位克隆奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

鑒定了13 477 個(gè)可進(jìn)行標(biāo)記開(kāi)發(fā)的SSR 位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)、檢測(cè)了5 859 個(gè)基因相關(guān)SSR 標(biāo)記，在栽培種花生基因組中具有較高的擴(kuò)增效率，并構(gòu)建了基因相關(guān)SSR 位點(diǎn)的物理圖譜。