內蒙古額濟納旗亞洲璃眼蜱的鑒定及其基因多態(tài)性分析

王云沖,黃天鵬,格日勒圖

(內蒙古農業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內蒙古 呼和浩特 010018)

內蒙古位于我國北部邊陲，擁有中國最大的天然草場，屬于中國最重要的畜牧產業(yè)基地。草原上的野生動物和自然放牧的家畜均為蜱蟲侵襲的主要對象，這樣的環(huán)境為蜱蟲的孳生提供了必要的條件。據(jù)1984年統(tǒng)計內蒙古的硬蜱有16種[1]，2008年陳澤等[2]報道內蒙古共有硬蜱15種。在2014年王建軍等[3]經過標本檢測和文獻檢索統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，內蒙古蜱類共有硬蜱21種，其中硬蜱科硬蜱亞科硬蜱屬4種(草原硬蜱、全溝硬蜱、長蝠硬蜱和嗜鳥硬蜱)、血蜱亞科血蜱屬5種(草原血蜱、日本血蜱、長角血蜱、鈴頭血蜱和嗜群血蜱)、扇頭蜱亞科璃眼蜱屬5種(亞洲璃眼蜱、殘緣璃眼蜱、盾糙璃眼蜱、亞東璃眼蜱和麻點璃眼蜱)，革蜱屬5種(銀盾革蜱、邊緣革蜱、草原革蜱、森林革蜱和中華革蜱)，扇頭屬2種(短小扇頭蜱和血紅扇頭蜱)。額濟納隸屬于內蒙古自治區(qū)阿拉善盟，地處中國北疆，位于內蒙古自治區(qū)最西端，西南與甘肅省交界，北與蒙古國接壤[4]。氣候呈干旱少雨，蒸發(fā)量大，日照充足，溫差較大，風沙多等特點。駱駝、黃羊和野驢等是該地區(qū)主要的動物種類。這種半荒漠和荒漠環(huán)境條件，為亞洲璃眼蜱的生活和繁殖提供了有利的條件，內蒙古地區(qū)存在的璃眼蜱屬都分布在阿拉善地區(qū)，其中亞洲璃眼蜱屬于內蒙古額濟納地區(qū)的優(yōu)勢蜱種[5]。

亞洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)，蛛形綱(Arachnida)，蜱螨目(Acaridae)，硬蜱科(Ixodidae)。璃眼蜱屬(Hyalomma)主要分布在荒漠和半荒漠地區(qū)，能夠在灌木叢和胡楊林環(huán)境中生存，主要寄生宿主為雙駝峰、牛、馬、羊和野豬等動物，也能侵襲人[6-7]。亞洲璃眼蜱也是多種自然疫源性疾病的傳播媒介，主要包括新疆出血熱(Crimean hemorrhagic fever)、環(huán)形泰勒蟲病(Theileriaannulata)和Q熱病(Q fever)等[8-10]，對我國畜牧業(yè)的發(fā)展及人類的健康帶來很大的威脅。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，很多現(xiàn)已應用到蜱蟲的種型鑒定及其多態(tài)性研究等多個領域中[11]。在基因水平上對蜱蟲種型進行鑒定，最常用的基因是16S rRNA基因、COⅠ基因以及ITS2基因等[12]。該技術可得到準確的遺傳信息，為了解蜱蟲的起源、類群間的進化和演化關系等提供基礎信息。本研究運用傳統(tǒng)形態(tài)學和分子生物學相結合的方法對該地區(qū)蜱種進行鑒定，并通過生物信息學軟件對不同采樣點蜱蟲的基因多態(tài)性進行分析，為后期開展地方性蜱種研究與蜱傳疾病的防制工作提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑瓊脂糖、溴化乙錠，均購自Sigma公司；質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒，均購自AxyGEN公司；pMD19-T載體、Premix Taq，均購自TaKaRa公司。

1.2 儀器解剖顯微鏡，購自日本OLYMPUS公司；紫外凝膠成像系統(tǒng)，購自法國Vilber公司；電熱恒溫水浴鍋，購自上海一恒科學儀器有限公司；電子天平，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；水平電泳槽，購自美國BIO-RAD有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，購自江蘇太倉試驗設備廠；多功能酶標儀和PCR儀，購自基因有限公司。

1.3 蜱蟲2017年5月，從內蒙古阿拉善額濟納旗與蒙古國接壤附近區(qū)域選取3個采樣點，分別為黑城(125只)、七號山(141只)和居延海(117只)。用常規(guī)方法在駱駝(未藥浴)的體表共采集383只寄生硬蜱，并置于70%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 硬蜱形態(tài)學鑒定用解剖顯微鏡(OLYMPUS SZ51)進行鏡下觀察，根據(jù)硬蜱的形態(tài)學特征進行初步鑒定，主要觀察假頭基、須肢、盾板、生殖孔、足轉節(jié)、肛溝和氣門板等形態(tài)特征[13]，從而確定蜱種。

1.5 核酸提取將硬蜱先用酒精浸泡滅殺體表寄生病原，再用PBS沖洗3次[14]。液氮速凍后，用無菌研磨棒在1.5 mL離心管中研碎，加入已65℃預熱的2% CTAB抽提緩沖液，按照CTAB方法提取硬蜱核酸[15]。

1.6 引物設計及合成參考GenBank不同硬蜱的16S rRNA，應用Primer 5.0設計硬蜱16S rRNA 的擴增引物；參考文獻中擴增蜱蟲COⅠ基因的引物，引物序列如表1所示。該引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物序列及目的片段長度

1.7 基因擴增及測序以提取的蜱蟲DNA為模板，經PF1和PR1與PF2和PR2兩對引物進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：DNA模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Premix Taq 10 μL，滅菌去離子水 6 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，46℃(16S rRNA基因)和55℃(COⅠ基因)退火40 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃總延伸10 min。PCR擴增結束后，1%瓊脂糖凝膠電泳，再按照AxyGEN DNA凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段。膠回收產物與pMD19-T載體連接，連接體系為10 μL：目的片段4 μL，pMD19-T載體1 μL，SolutionⅠ 5 μL，4℃連接過夜。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，并在含氨芐青霉素的普通LB固體培養(yǎng)基上進行陽性克隆篩選。挑取可疑菌落，接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，使用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒，對其進行PCR和雙酶切鑒定，各取5 μL PCR產物和酶切產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將陽性質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.8 系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構建利用Mega 7.0[16]生物學軟件中最大似然法(maximum likelihood method)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析模型為Kimura2-parameter，進行1 000次自主復制(bootstrap replication)，以確定模型的穩(wěn)定性，最終獲得系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.9 蜱蟲16S rRNA基因多態(tài)性的分析從黑城、七號山和居延海3個采樣地點，分別隨機選擇10個樣本進行蜱蟲16S rRNA基因測序，應用Genetyx-Version 6軟件對30個測序序列進行同源比對，并分析其16S rRNA基因的多態(tài)性。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定結果如圖1所示，經傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定采自內蒙古阿拉善額濟納旗的383只蜱蟲均符合亞洲璃眼蜱的形態(tài)特征：軀體呈卵圓形；假頭長，假頭基側緣略凸出；頸溝深而長，相當明顯；背突細窄；基節(jié)Ⅰ外距窄長，基節(jié)Ⅱ～Ⅳ外距粗短，按節(jié)序漸?。蛔|短小，不及爪長之半，各關節(jié)處有明亮淡黃色環(huán)帶，在背緣也有同樣淡色的縱帶。雌蟲，假頭基后緣近于直；基突付缺，盾板橢圓多角形，長勝于寬，后緣尖窄，略呈角狀；氣門板逗點形，足粗細適中。雄蟲，假頭基后緣呈角狀內凹，基突粗大而鈍；盾板卵圓形，前部漸窄，后緣鈍圓；氣門板曲頸瓶形，足按足序漸粗。

圖1 亞洲璃眼蜱形態(tài)學鑒定 A.雄性蜱蟲；B.雌性蜱蟲；A1、B1.背面;A2、B2.假頭基;A3、B3.緣垛;A4、B4.腹面;A5、B5.生殖孔;A6、B6.肛溝

2.2 亞洲璃眼蜱16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果如圖2所示，從GenBank中選取代表性蜱蟲的16S rRNA基因序列19個，運用Mega 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，阿拉善額濟納旗采集的蜱蟲樣本與新疆的亞洲璃眼蜱在同一個分支上并能夠產生很好的聚類。

圖2 基于16S rRNA基因序列ML法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 亞洲璃眼蜱COⅠ基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析結果如圖3所示，從GenBank中選取代表性蜱蟲的COⅠ基因序列18個，運用Mega 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹，阿拉善額濟納旗采集的蜱蟲樣本與新疆的亞洲璃眼蜱在同一的分支上能夠產生很好的聚類。

圖3 基于COⅠ基因序列ML法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4 亞洲璃眼蜱16S rRNA基因多態(tài)性分析應用Genetyx-Version 6軟件對30個樣品的16S rRNA基因序列進行同源性比對分析，如圖4所示，A6序列與其他29個樣品存在基因多態(tài)性的變化，包括5處A?T堿基點突變，1處G?T堿基點突變，1處A?G堿基點突變。B8序列與其他序列也存在1處G?A堿基點突變。B9序列與其他序列也存在1處C?T堿基點突變。

圖4 亞洲璃眼蜱16S rRNA的基因多態(tài)性 A1～A10.黑城地區(qū)亞洲璃眼蜱16S rRNA基因序列;B1～B10.七號山地區(qū)亞洲璃眼蜱16S rRNA基因序列;C1～C10.居延海地區(qū)亞洲璃眼蜱16S rRNA基因序列

3 討論

亞洲璃眼蜱可以通過直接叮咬的方式對宿主的皮膚造成危害，導致宿主皮膚發(fā)生充血和水腫等病理變化，使動物產生疼痛、過敏性皮炎和傷口蛆病等癥狀。更為重要的是，亞洲璃眼蜱也是多種病原微生物的重要傳播媒介[17-18]，給內蒙古阿拉善地區(qū)畜牧產業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的威脅。另外，國內外對亞洲璃眼蜱的基因多態(tài)性的研究鮮有報道。因此本研究為阿拉善地區(qū)亞洲璃眼蜱的鑒定以及在遺傳進化過程中產生的基因多態(tài)性的研究奠定基礎。

目前蜱蟲的鑒定不僅可以依靠傳統(tǒng)形態(tài)學的鑒定方法，隨著近幾年分子生物學的飛速發(fā)展，分子生物學手段也成功地被應用到了蜱蟲的鑒定中。在本研究中我們借助解剖鏡觀察，并參考《中國經濟昆蟲志》對于蜱蟲形態(tài)學的描述[19-20]，發(fā)現(xiàn)采集的蜱蟲在外觀形態(tài)、假頭基、肛后板及足等特殊結構均符合亞洲璃眼蜱的形態(tài)特征，但雌性蜱蟲飽血后發(fā)生了部分的形變，如雌性蜱蟲的生殖孔變小。但運用傳統(tǒng)形態(tài)學方法對蜱蟲鑒定還需要有經驗的專家才能夠進行確認，對于一般科研工作者和檢疫人員，想熟練掌握蜱蟲傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法是相對困難的，因此我們又采用了分子生物學的方法進行蜱蟲的種型鑒定。結果顯示無論是蜱蟲的16S rRNA基因序列還是COⅠ基因序列，都能夠與NCBI中已知的亞洲璃眼蜱達到99%以上的同源性。從16S rRNA基因和COⅠ基因的系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果中可以確認，我們采集的蜱蟲與來自新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱在同一個進化分支上，并能夠很好的形成聚類，表明所采集的蜱蟲與來自新疆地區(qū)的亞洲璃眼蜱可能來自于同一祖先蜱，這一結果與傳統(tǒng)形態(tài)學的鑒定結果相吻合，證明我們采集的蜱蟲為亞洲璃眼蜱，這為內蒙古地區(qū)蜱蟲的分布調查補充了有利的數(shù)據(jù)。

通過Genetyx-Version 6軟件對3個不同采集的地區(qū)的亞洲璃眼蜱進行多態(tài)性分析，在亞洲璃眼蜱16S rRNA的基因多態(tài)性結果中，發(fā)現(xiàn)除A6、B8和B9序列外，其他27個樣品均不存在基因多態(tài)性，表明該該地區(qū)亞洲璃眼蜱存在比較緩慢的進化速率。而A6序列與其他29個序列存在基因多態(tài)性的變化，包括5處A?T堿基點突變，1處G?T堿基點突變，1處A?G堿基點突變。B8序列與其他序列也存在1處G?A堿基點突變。B9序列與其他序列也存在1處C?T堿基點突變?？梢娀蚨鄳B(tài)性的變化是存在的，不同的地域環(huán)境給蜱蟲的進化帶來了影響，蜱蟲為了更好地適應環(huán)境的變化而產生了基因多態(tài)性的變化。但本研究也存在不足的地方，樣品分析的統(tǒng)計數(shù)量不足，很難對蜱蟲基因多態(tài)性的變化進行證實，但在如此少的樣品中就存在基因多態(tài)性的變化，說明基因多態(tài)性的變化肯定是存在的，這些數(shù)據(jù)為蜱蟲種群分析及蜱傳疾病的探索等研究工作奠定了基礎。