火雞組織滴蟲不同地區(qū)分離株的致病性比較

禚振男，孔令明，郭 平，曲昌寶，王子靜，劉丹丹，陶建平，許金俊*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009;3.山東省諸城市畜牧獸醫(yī)局，山東 諸城 262200)

組織滴蟲病是由火雞組織滴蟲引起的雞形目禽類的一種原蟲病，以肝臟壞死、盲腸腫大和排硫磺樣糞便為主要特征[1]。組織滴蟲病在火雞中的死亡率接近100%，而在雞中僅有10%～20%的病死率[2]。出于公共衛(wèi)生的考慮，目前用于預(yù)防和治療組織滴蟲病的藥物基本已被禁止和限制使用，而使用驅(qū)蟲劑雖然可以控制通過雞異刺線蟲的傳播，但不能預(yù)防通過泄殖腔途徑的水平傳播，使得該病在火雞群和雞群中經(jīng)常暴發(fā)和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。已有研究報道表明，火雞組織滴蟲激發(fā)機(jī)體的免疫以細(xì)胞免疫為主，且體外連續(xù)培養(yǎng)傳代后其毒力會顯著降低，對火雞和雞安全無副作用，免疫后能有效抵抗強(qiáng)毒的感染，因此，研制能激發(fā)細(xì)胞免疫且安全的致弱活疫苗是該病免疫預(yù)防的有效途徑，有很好的應(yīng)用前景[4-5]。

組織滴蟲病暴發(fā)時，一些火雞群或者雞群僅表現(xiàn)出輕微發(fā)病和死亡，而有些火雞群或者雞群則表現(xiàn)較高的死亡率。這些差異表明，在火雞組織滴蟲中不同蟲株間的毒力可能存在差異性，不同蟲株之間存在不同的基因型差異[6]。本研究通過火雞組織滴蟲泄殖腔感染黃羽肉雞的方法，比較了從江蘇揚(yáng)州市不同地區(qū)分離得到的2株火雞組織滴蟲JSYZ-A和JSYZ-B致病力的差異，為進(jìn)一步建立動物感染模型，開展組織滴蟲病致弱活疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑Medium 199(1×)、滅活馬血清購自美國Gibco公司；米粉購自美國Sigma-Aldrich公司；臺盼藍(lán)染色液購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)動物與蟲株1日齡蘇禽黃羽肉雞30只，購自中國農(nóng)科院家禽研究所育種中心，出殼后即飼喂在嚴(yán)格消毒的適宜環(huán)境中，供給充足的水和飼料，飼料和水中未添加任何藥物。

火雞組織滴蟲JSYZ-A株為從江蘇省揚(yáng)州市儀征市暴發(fā)組織滴蟲病的草雞群中分離得到的單克隆蟲株；JSYZ-B株為從江蘇省揚(yáng)州市邗江區(qū)暴發(fā)組織滴蟲病的草雞群中分離得到的單克隆蟲株。蟲株在含90% M199培養(yǎng)基，10%馬血清，11 mg米粉和健康雞盲腸細(xì)菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中40℃厭氧培養(yǎng)繁殖，在含10%二甲基亞砜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行液氮凍存，并且凍存的蟲株能夠成功復(fù)蘇。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對復(fù)壯培養(yǎng)2 d的火雞組織滴蟲JSYZ-A和JSYZ-B株經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，調(diào)整各株火雞組織滴蟲的數(shù)量達(dá)到105個/mL，吸取1 mL培養(yǎng)液分裝到10個1.5 mL EP管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清700 μL，將沉淀輕輕吹勻，接種前放入40℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。將飼養(yǎng)至7 d的蘇禽黃羽肉雞測體質(zhì)量，隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組體質(zhì)量基本一致。A組感染火雞組織滴蟲JSYZ-A株，B組感染火雞組織滴蟲JSYZ-B株，C設(shè)為陰性對照組接種空白對照培養(yǎng)基，各組均經(jīng)泄殖腔感染途徑感染，試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)見表1。感染后每天觀察記錄雞的精神、食欲、糞便、發(fā)病與死亡情況，死亡雞立即剖檢觀察內(nèi)臟病變。感染后15 d 對所有組存活的雞測體質(zhì)量并撲殺。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和接種途徑

1.4 蟲株的致病力評價以每組的病死率、平均增重、相對增重率和病變計(jì)分作為主要評價指標(biāo)：病死率(%)=(死亡雞數(shù)/開始雞數(shù))×100%；平均增重=(試驗(yàn)結(jié)束時體質(zhì)量-接種時體質(zhì)量)/試驗(yàn)天數(shù)；相對增重率(%)=接種組平均增重÷未接種組平均增重；盲腸和肝臟病變計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]的標(biāo)準(zhǔn)，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

盲腸：0分.盲腸壁縱向褶皺特征良好，缺乏肉眼可見的損害，盲腸內(nèi)容物呈稠狀，糞便深色，沒有干酪樣的滲出液；1分.盲腸壁增厚或存在散在瘀點(diǎn)，或兩者兼而有之；2分.盲腸壁增厚適中，盲腸有干酪樣滲出液或內(nèi)容物形成干酪樣核心，盲腸內(nèi)容物顏色改變或盲腸沒有內(nèi)容物和出血點(diǎn)；3分.盲腸壁增厚，盲腸內(nèi)容物呈明顯的干酪核心，或盲腸無內(nèi)容物或盲腸壁出現(xiàn)瘀點(diǎn)；4分.盲腸壁顯著增厚，盲腸黏膜層出現(xiàn)纖維性壞死和潰瘍，盲腸內(nèi)有干酪樣核心或無內(nèi)容物，存在出血性盲端，或盲腸斷裂導(dǎo)致腹膜炎發(fā)生。

肝臟：0分.沒有肉眼可見的圓形壞死灶；1分.存在1～5個小型的圓形壞死灶(直徑小于5 mm)；2分.出現(xiàn)許多小的圓形壞死灶(超過5個)，或出現(xiàn)大的壞死灶(直徑超過5 mm)；3分.肉眼可見許多小的和大的壞死灶；4分.呈現(xiàn)復(fù)雜病灶和許多混合性損害。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析用SPSS軟件對平均增重進(jìn)行一維方差描述性統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用GraphPad Prism 軟件對肝臟和盲腸平均病變計(jì)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以P<0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病和死亡情況于感染6～7 d后，雞群開始發(fā)病，病雞表現(xiàn)為精神萎靡，食欲下降，羽毛蓬亂，糞盤中出現(xiàn)硫磺樣糞。A組發(fā)病情況相較B組情況稍微嚴(yán)重，C組未出現(xiàn)任何癥狀。感染JSYZ-B株的B組在感染后15 d內(nèi)雞未出現(xiàn)死亡，感染JSYZ-A株的A組在感染后15 d內(nèi)雞死亡1只，病死率為10%。

2.2 平均增重與相對增重率感染后15 d撲殺時各組的增重情況詳見由表2。結(jié)果顯示，3組試驗(yàn)雞感染前的平均體質(zhì)量差異不顯著(P>0.05)；感染15 d 后試驗(yàn)結(jié)束，空白對照組C與感染A、B組的平均體質(zhì)量和平均增重差異顯著(P<0.05)，蟲株感染后增重顯著降低；不同株對試驗(yàn)雞體質(zhì)量有一定影響，其中JSYZ-A株對增重的影響稍大于JSYZ-B株，但不同蟲株間的平均增重和相對增重率的差異不顯著(P>0.05)。

2.3 病變計(jì)分不同蟲株感染引起雞盲腸和肝臟病變損傷計(jì)分的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖1。由圖1可知，JSYZ-B株與JSYZ-A株的肝臟病變計(jì)分存在顯著性差異(P<0.05)，而盲腸病變計(jì)分差異不顯著。感染后15 d部分雞肝臟和盲腸的大體病變見圖2。

表2 不同蟲株感染對雞增重的影響 g

3 討論

自火雞組織滴蟲病首次報道以來，已經(jīng)有過不少關(guān)于人工感染模型建立方面的研究和探索?，F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)獲得成功的感染方式有：將禽類暴露于蟲體污染的土壤與或水；經(jīng)口感染的陽性禽類的組織器官或排出糞便，或口服含有火雞組織滴蟲蟲體的雞異刺線蟲卵，或口服蚯蚓；經(jīng)過泄殖腔接種陽性禽類感染的臟器或糞便，或泄殖腔接種含有火雞組織滴蟲蟲體的異刺線蟲的幼蟲等等。但是，這些方法或途徑均存在影響因素多、不可控、難以重復(fù)和復(fù)制等缺點(diǎn)，在一定程度程度上也制約了該病的研究[3]。近十年來，隨著火雞組織滴蟲體外分離培養(yǎng)技術(shù)的成功，口服和經(jīng)泄殖腔接種體外培養(yǎng)的蟲體相比過去常用的方法結(jié)果更為可靠和信賴，重復(fù)性也更好，兩者相比，

圖1 不同蟲株感染雞的盲腸和肝臟病變計(jì)分統(tǒng)計(jì)分析

圖2 火雞組織滴蟲人工感染15 d后的大體病變 A.JSYZ-A株感染雞的肝臟、盲腸；B.JSYZ-B株感染雞的肝臟、盲腸

尤以泄殖腔接種效果最佳[7]。大多數(shù)的研究者通過研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)泄殖腔感染火雞組織滴蟲時，感染體積應(yīng)該控制在0.5～1.0 mL，并且在感染后需要將雞倒提5 min，以防止培養(yǎng)基流出，影響感染效果[8]。研究中我們發(fā)現(xiàn)，泄殖腔感染體積為0.3 mL時感染效果最佳，并且因其感染體積小，對直腸的刺激微弱，不易引起雞的努責(zé)排便。此外，在接種前6 h 對雞進(jìn)行禁飼，能夠提高火雞組織滴蟲感染的成功率。

無論是自然感染還是人工感染，火雞組織滴蟲在不同品種、品系或不同地區(qū)的家禽群體中導(dǎo)致的發(fā)病率、病死率、臨床表現(xiàn)和臟器的大體變化均有不同程度的差異[3,7]。究其原因，禽類年齡、感染劑量、品系以及不同地區(qū)的蟲株來源均會導(dǎo)致這種差異的產(chǎn)生[9-11]， 其中毒力和基因型差異是一個重要的因素[6]。本試驗(yàn)感染的蟲株為雞源火雞組織滴蟲JSYZ-A株和JSYZ-B株分別分離自揚(yáng)州儀征市和揚(yáng)州邗江區(qū)，兩者的實(shí)驗(yàn)室的體外培養(yǎng)過程和傳代環(huán)境及次數(shù)是相同的。從人工感染的病死率和對肝臟、盲腸的損傷情況證實(shí)，JSYZ-A株的毒力更強(qiáng)，尤其在導(dǎo)致臟器的組織損傷方面差異顯著，進(jìn)一步驗(yàn)證了不同地區(qū)分離獲得的火雞組織滴蟲蟲株的毒力存在一定的差異。為進(jìn)一步建立體外動物模型，研究其致病機(jī)制奠定了很好的基礎(chǔ)，也為致弱活疫苗的制備提供了很好的候選蟲株。