鹿角蕨孢子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)研究

葉秀仙　陳藝荃　方能炎　吳建設(shè)　鐘淮欽

摘要：【目的】建立鹿角蕨孢子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)體系，為鹿角蕨規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支撐。【方法】以鹿角蕨孢子為外植體，采用3種不同消毒方法進(jìn)行孢子滅菌與萌發(fā);利用正交設(shè)計(jì)法，探討基本培養(yǎng)基（MS、改良1號(hào)和改良2號(hào)）及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、KT、NAA和IBA）等對(duì)綠色球狀體（GGB）增殖、叢生芽增殖及生根培養(yǎng)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響，篩選出適宜的孢子消毒方法及GGB增殖、叢生芽增殖和生根培養(yǎng)基配方。【結(jié)果】適宜孢子消毒的方法為超聲波清洗器振蕩清洗40 min，污染率低，僅為6.7%，孢子萌發(fā)率高達(dá)100.0%;各試驗(yàn)因素對(duì)GGB增殖影響的主次關(guān)系為基本培養(yǎng)基>6-BA>CH>NAA，以改良1號(hào)為基本培養(yǎng)基較好，6-BA適宜濃度為0.5 mg/L，NAA適宜濃度為0.1 mg/L，CH適宜濃度為0.2 g/L，42 d平均增殖系數(shù)達(dá)5.5;各試驗(yàn)因素對(duì)叢生芽增殖影響的主次關(guān)系為IBA>6-BA>NAA>KT，IBA適宜濃度為0.5 mg/L，6-BA適宜濃度為0.3 mg/L，KT適宜濃度為0.1 mg/L，NAA適宜濃度為0.3 mg/L，60 d平均增殖系數(shù)達(dá)5.3;添加NAA 0.3 mg/L為最適濃度，生根率為100.0%;試管苗移栽60 d成活率達(dá)98.5%。【結(jié)論】超聲波清洗器振蕩清洗40 min能有效降低鹿角蕨孢子污染率，提高孢子萌發(fā)率。鹿角蕨GGB增殖培養(yǎng)基以改良1號(hào)+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.2 g/L較適宜，叢生芽增殖培養(yǎng)基以改良2號(hào)+6-BA 0.3 mg/L+ KT 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L較適宜，生根培養(yǎng)基以改良1號(hào)+ NAA 0.3 mg/L較適宜。

關(guān)鍵詞： 鹿角蕨;超聲波;綠色球狀體;正交設(shè)計(jì);快速繁殖

中圖分類號(hào)： S682.35 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）11-2773-08

Spore germination and rapid propagation of Platycerium wallichii Hook.

YE Xiu-xian1， CHEN Yi-quan2， FANG Neng-yan1， WU Jian-she1， ZHONG Huai-qin1*

（1Institute of Crop Sciences，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Science， Fuzhou ?350013， China; 2Institute of Agricultural Engineering and Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou ?350003， China）

Abstract：【Objective】The technique system of spore germination and rapid propagation of Platycerium wallichii Hook. was established to provide technical support for large-scale breeding of P. wallichii. 【Method】The spores of P. wallichii were explants， they were sterilized and germinated by three different disinfection methods.The orthogonal design was used to study the effects of the key factors such as culture medium（MS， Improvement #1 and Improvement #2），phytohormone（6-BA，KT，NAA and IBA）on the proliferation of ?green globular body（GGB），multiplication of cluster buds and rooting culture，the suitable spore disinfection method and the medium formula of GGB multiplication，cluster bud multiplication and rooting were selected. 【Result】The suitable method of spore disinfection was washed with ultrasonic wave cleaner for 40 min，the contamination rate was only 6.7% ，the spore germination rate was as high as 100.0% . The primary and secondary relationship of each experimental factor to the bud multiplication was the basic medium>6-BA>CH>NAA. The best multiplication medium was Improvement # 1，the proper concentrations were 6-BA 0.5 mg/L， NAA 0.1 mg/L，and CH 0.2 g/L， ?resulted in an averaged propagation coefficient of 5.5 in 42 d. The primary and secondary relationship of each experimental factor to the multiplication of GGB was IBA>6-BA>NAA>KT，the optimum concentration of IBA was 0.5 mg/L，6-BA was 0.3 mg/L，KT was 0.1 mg/L，the optimum concentration of NAA was 0.3 mg/L，the average multiplication coefficient was 5.3 on 60 d. The optimum concentration of NAA was 0.3 mg/L，the rooting rate was 100.0%，and the survival rate of plantlets transplanted in vitro was 98.5% on 60 d. 【Conclusion】When spores are washed with ultrasonic wave cleaner for 40 min，the disinfection effect is good and the germination rate is high，the suitable medium for GGB proliferation is Improvement #1+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.2 g/L，the best medium for multiplication of cluster buds is Improvement #2+6-BA 0.3 mg/L+ KT 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L，and the best medium for rooting is Improvement #1+NAA 0.3 mg/L.

Key words： Platycerium wallichii Hook.; ultrasonic wave; green globular body; orthogonal design; rapid propagation

Foundation item： Basic Research Project of Fujian Public Welfare Research Institutes（2017R1026-9）; Technology ?Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences（STIT2017-2-9）

0 引言

【研究意義】鹿角蕨（Platycerium wallichii Hook.）為鹿角蕨科鹿角蕨屬多年生常綠草本植物，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，在我國(guó)主要分布于云南西南部盈江縣那邦壩，生長(zhǎng)于海拔210～950 m的山地雨林中，緬甸、印度東北部及泰國(guó)也有分布（沈曉嵐等，2008;張哲等，2018）。鹿角蕨常作為室內(nèi)垂吊或壁掛的觀賞植物，是室內(nèi)觀葉植物中珍貴稀有的精品，也是室內(nèi)立體綠化的好材料，應(yīng)用前景廣闊。目前，鹿角蕨常用的繁殖方法包括分株繁殖和孢子繁殖，但分株繁殖的繁殖系數(shù)較小，而孢子繁殖的孢子自然萌發(fā)率較低，均限制了其在鹿角蕨繁殖中的應(yīng)用。因此，急需攻克鹿角蕨孢子無(wú)菌播種繁殖技術(shù)，解決育苗技術(shù)，為鹿角蕨資源保護(hù)及人工繁育提供技術(shù)保障?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于鹿角蕨繁殖方面的研究國(guó)內(nèi)已有一些報(bào)道。王承義和王穎（2000）報(bào)道了細(xì)胞分裂素和蔗糖對(duì)鹿角蕨芽分化的影響，認(rèn)為6-BA較適宜于誘導(dǎo)鹿角蕨不定芽分化，用糖量為30 g/L時(shí)不定芽增殖率最高。黃執(zhí)纓（2004）以二歧鹿角蕨幼嫩真葉為外植體建立了鹿角蕨組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選出適宜幼嫩真葉誘導(dǎo)綠色球狀體（GGB）的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.05 mg/L，GGB誘導(dǎo)叢生芽適宜的培養(yǎng)基為MS+KT 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L。郭撿等（2012，2013）研究表明，鹿角蕨孢子萌發(fā)適宜溫度為20～30 ℃，在黑暗條件下孢子不萌發(fā)，孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育最適光照強(qiáng)度為60～80 μmol/（m2·s），配子體在pH 4.5～7.5的范圍均可正常發(fā)育，蔗糖濃度≤2%的培養(yǎng)條件更利于孢子的萌發(fā)及原葉體的形成，當(dāng)幼孢苗株高達(dá)2～3 cm時(shí)即可移栽。國(guó)外也有一些關(guān)于鹿角蕨繁殖的研究，Camloh和Gogala（1991）研究表明，在改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)二歧鹿角蕨幼葉誘導(dǎo)不定芽，無(wú)需添加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，6-BA甚至?xí)种蒲康纳L(zhǎng)，生根培養(yǎng)中影響根系發(fā)育的主要因素是培養(yǎng)基的濃度，IBA處理不促進(jìn)生根;Camloha等（1994）研究發(fā)現(xiàn)，以二歧鹿角蕨幼葉為外植體，在經(jīng)Hennen和Sheehan改良過(guò)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA，可誘導(dǎo)出不定芽，但在不添加6-BA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d的外植體中，大多數(shù)外植體可產(chǎn)生10～35個(gè)芽;Kwa等（1997）研究發(fā)現(xiàn)，在皇冠鹿角蕨細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生愈傷組織的形態(tài)發(fā)生過(guò)程中，與淺綠色孢子體愈傷組織相比，深綠色配子體愈傷組織的生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生速度更快;Teng（1997）研究表明，二歧鹿角蕨葉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中加入活性炭可極大增加再生孢子體的數(shù)量，其改善程度取決于細(xì)胞團(tuán)塊大小和培養(yǎng)基組成?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于鹿角蕨組織培養(yǎng)的報(bào)道大多以幼孢子體莖尖或葉片為外植體，存在繁殖效率低等問(wèn)題，且鹿角蕨不同品種對(duì)培養(yǎng)基的要求不同，不同激素對(duì)不同品種的效應(yīng)也存在差異?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用二歧鹿角蕨孢子無(wú)菌萌發(fā)形成GGB的快速繁殖途徑，篩選適宜孢子消毒的滅菌方法及GGB增殖、叢生芽增殖和試管苗生根培養(yǎng)基配方，建立孢子萌發(fā)與快速繁殖技術(shù)體系，為鹿角蕨規(guī)?；缣峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在福建省特色花卉工程技術(shù)研究中心花卉育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。以二歧鹿角蕨（Platycerium bifurcatum）孢子作為啟動(dòng)培養(yǎng)的外植體。試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;白糖為優(yōu)質(zhì)白砂糖（廈門(mén)古龍牌）;瓊脂粉、卡拉膠（日本），強(qiáng)度1400 g/cm2;花寶1號(hào)（美國(guó)），其N∶P∶K質(zhì)量比7∶6∶19。超聲波清洗器為舒美牌旋鈕型臺(tái)式超聲波清洗器（型號(hào)KQ-100E，昆山市超聲儀器有限公司），其主要技術(shù)參數(shù)：清洗槽容量4 L，超聲功率100 W，超聲頻率40 KHz，加熱功率400 W，溫度常溫至80 ℃可調(diào)。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體消毒滅菌 從鹿角蕨健康母株上切取帶有成熟孢子的葉片，用自來(lái)水沖洗干凈，將葉片切割成2.0 cm×5.0 cm的片塊，在超凈工作臺(tái)上采取3種不同消毒方法進(jìn)行滅菌處理：（1）75%酒精30 s+0.1% HgCl2溶液浸泡 8 min+無(wú)菌水沖洗5次;（2）75%酒精30 s+0.1% HgCl2溶液浸泡4 min+無(wú)菌水沖洗3次+超聲波清洗器振蕩清洗20 min;（3）超聲波清洗器振蕩清洗40 min。其中超聲波清洗器清洗槽中添加的清洗液為無(wú)菌水，接種室空調(diào)溫度為25 ℃。外植體經(jīng)3種方法處理后，分別取出放入無(wú)菌容器中，再用無(wú)菌紙巾吸干水分，用無(wú)菌刀片刮下孢子，備用。

1. 2. 2 孢子萌發(fā) 將上述不同消毒方法處理好的孢子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基MS+TDZ 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+白糖30.0 g/L+瓊脂粉5.0 g/L中進(jìn)行培養(yǎng)，每處理接種10瓶，3次重復(fù)，并定期觀察污染與萌發(fā)情況，接種30 d后統(tǒng)計(jì)污染率與孢子萌發(fā)率。

1. 2. 3 GGB增殖與芽分化 以孢子萌發(fā)獲得的GGB為增殖培養(yǎng)材料，采用4因素3水平L9（34）正交設(shè)計(jì)，選擇基本培養(yǎng)基、6-BA、NAA、水解酪蛋白（CH）為試驗(yàn)因素，各設(shè)3個(gè)水平（表1）。各處理培養(yǎng)基均附加白糖30.0 g/L、瓊脂粉3.0 g/L、卡拉膠3.0 g/L。每處理接種5瓶，每瓶接入GGB重量5.0～6.0 g，3次重復(fù)，共9個(gè)處理。

將增殖獲得的GGB接種到芽分化培養(yǎng)基改良2號(hào)+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+白糖30.0 g/L+瓊脂粉5.0 g/L中進(jìn)行芽分化培養(yǎng)。

改良1號(hào)基本培養(yǎng)基組分：花寶1號(hào)1.80 g/L、KNO3 0.95 g/L、（NH4）2SO4 0.85 g/L、KH2PO4 0.25 mg/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、CaCl2·2H2O 0.40 g/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L、Na2·EDTA 37.30 mg/L、VB1 10.00 mg/L、VB5 5.00 mg/L、VB6 1.00 mg/L、甘氨酸2.00 mg/L、肌醇150.00 mg/L。

改良2號(hào)基本培養(yǎng)基組分：花寶1號(hào)1.20 g/L、KNO3 0.95 g/L、（NH4）2SO4 0.85 g/L、KH2PO4 0.25 mg/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、CaCl2·2H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 16.90 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、H3BO3 6.20 mg/L、KI 0.83 mg/L、Na2MoO2·2H2O 0.25 mg/L、CoCl2·6H2O 0.025 mg/L、CuSO4·5H2O 0.025 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L、Na2·EDTA 37.30 mg/L、VB1 5.0 mg/L、VB5 3.0 mg/L、VB6 1.0 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L、肌醇180.0 mg/L。

1. 2. 4 叢生芽增殖培養(yǎng) 以上述分化培養(yǎng)獲得的小芽為叢生芽增殖培養(yǎng)材料，芽增殖采用4因素3水平L9（34）正交設(shè)計(jì)，以改良2號(hào)為基本培養(yǎng)基，選擇6-BA、KT、NAA、IBA為試驗(yàn)因素，各因素取3個(gè)水平（表2）。各處理培養(yǎng)基均附加瓊脂粉3.0 g/L、卡拉膠3.0 g/L、香蕉粉3.0 g/L、活性炭0.3 g/L、白糖30.0 g/L，每處理接種10瓶，每瓶接種12團(tuán)（每團(tuán)帶3～5個(gè)小芽），3次重復(fù)。增殖培養(yǎng)60 d時(shí)統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖系數(shù)（增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)）。

1. 2. 5 生根培養(yǎng) 將獲得的健壯叢生芽切割成單芽（芽大小為2.0～2.5 cm）作為生根培養(yǎng)材料，接種于以改良1號(hào)為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA（0、0.1、0.3、0.5 mg/L）、活性碳0.5 g/L、白糖20.0 g/L、香蕉粉3.0 g/L、瓊脂粉3.6 g/L及卡拉膠3.6 g/L的4種培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶接種25株，3次重復(fù)。生根培養(yǎng)75 d時(shí)統(tǒng)計(jì)生根情況。

1. 2. 6 煉苗移栽 當(dāng)幼苗長(zhǎng)至高4.0～5.0 cm、3～4片葉時(shí)，將其置于遮光率70%～80%的溫室中煉苗并進(jìn)行移栽種植，定期觀測(cè)植株移栽成活率及生長(zhǎng)表現(xiàn)。

1. 2. 7 培養(yǎng)方式與培養(yǎng)條件 以650 mL的組培瓶為培養(yǎng)容器，采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式，pH 5.6～5.8，培養(yǎng)溫度（24±3）℃，光照強(qiáng)度1500～2000 lx，光照時(shí)間10 h/d。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用正交設(shè)計(jì)助手v3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同消毒滅菌方法對(duì)鹿角蕨孢子萌發(fā)的影響

將消毒滅菌后的孢子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行無(wú)菌萌發(fā)，培養(yǎng)10～15 d，孢子由棕黃色逐漸轉(zhuǎn)綠，并膨脹生長(zhǎng)，產(chǎn)生類似蘭花原球莖的GGB（圖1）。培養(yǎng)30 d時(shí)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)與污染情況。從表3可知，不同消毒滅菌處理方法對(duì)孢子外植體滅菌和萌發(fā)的影響達(dá)顯著水平（P<0.05，下同），其中超聲波清洗振蕩40 min的污染率最低，僅為6.7%，顯著低于其他滅菌方法，且萌發(fā)率達(dá)100.0%，顯著高于其他滅菌方法。綜合考慮滅菌效果與萌發(fā)率，超聲波清洗器振蕩清洗的方法更適合于外植體的滅菌消毒。

2. 2 鹿角蕨GGB增殖與芽分化

2. 2. 1 GGB增殖 GGB接種14 d時(shí)，切口部位開(kāi)始膨大，21 d時(shí)不同處理組陸續(xù)增殖。增殖培養(yǎng)42 d時(shí)統(tǒng)計(jì)GGB增殖系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。表4結(jié)果表明，從k值可看出，在GGB增殖過(guò)程中，以改良1號(hào)為基本培養(yǎng)基較好，6-BA適宜濃度為0.5 mg/L，NAA適宜濃度為0.1 mg/L，CH適宜濃度為0.2 g/L;從R可看出，不同因素對(duì)GGB增殖影響的主次關(guān)系為A>B>D>C，說(shuō)明對(duì)GGB增殖起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是6-BA和CH，NAA對(duì)增殖的影響較小。GGB增殖最佳處理組合是A2B3C1D2，即改良1號(hào)+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.2 g/L，增殖培養(yǎng)42 d，平均增殖系數(shù)達(dá)5.5。

從表5可知，基本培養(yǎng)基、6-BA和CH這3種因素均顯著影響鹿角蕨GGB增殖系數(shù)，但其影響程度有明顯差異，表現(xiàn)為基本培養(yǎng)基>6-BA>CH，NAA對(duì)鹿角蕨GGB增殖系數(shù)無(wú)顯著影響（P>0.05，下同），與極差分析結(jié)果一致。

2. 2. 2 GGB分化出芽 將GGB接種到芽分化培養(yǎng)基改良1號(hào)+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L+白糖30.0 g/L+瓊脂粉5.0 g/L中進(jìn)行培養(yǎng)（葉秀仙等，2020）。培養(yǎng)30 d時(shí)，陸續(xù)分化出芽（圖2）。

2. 3 鹿角蕨叢生芽增殖

叢芽團(tuán)接種28 d時(shí)，芽基部切口部位開(kāi)始膨大，35 d時(shí)不同處理組陸續(xù)長(zhǎng)出叢生芽。增殖培養(yǎng)60 d時(shí)統(tǒng)計(jì)叢生芽增殖系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6和表7。從表6可知，從k值可看出，在鹿角蕨叢生芽增殖培養(yǎng)過(guò)程中，IBA適宜濃度為0.5 mg/L，6-BA適宜濃度為0.3 mg/L，KT適宜濃度為0.1 mg/L，NAA適宜濃度為0.3 mg/L;從R可看出，不同因素對(duì)叢生芽增殖影響的主次關(guān)系為D>A>C>B，說(shuō)明對(duì)鹿角蕨叢生芽增殖起主要作用的是IBA，其次是6-BA和NAA，KT對(duì)叢生芽增殖的影響較小。叢生芽增殖最佳處理組合是A2B1C2D3，即6-BA 0.3 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L，60 d平均增殖系數(shù)達(dá)5.3，實(shí)現(xiàn)了種苗大量繁殖，為規(guī)?；缣峁┝思夹g(shù)保障（圖3）。

從表7可知，IBA顯著影響鹿角蕨叢生芽增殖系數(shù)，其影響程度最大，與極差分析結(jié)果一致。其他因素對(duì)叢生芽增殖無(wú)顯著影響。

2. 4 鹿角蕨生根培養(yǎng)及移栽

從表8可知，在0～0.5 mg/L范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的升高，生根數(shù)和生根率均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度為0.3 mg/L時(shí)生根數(shù)最多，生根率最高，說(shuō)明添加NAA 0.3 mg/L為最適濃度。

當(dāng)苗高5.0～6.0 cm，具3～4片葉時(shí)，將瓶苗放置于遮光率70%～80%的溫室中煉苗約10 d，以提高瓶苗適應(yīng)力，適應(yīng)栽培環(huán)境。煉苗后進(jìn)行清水洗苗，洗凈根部粘連的培養(yǎng)基，然后將其置于1.0 g/L多菌靈或百菌清殺菌劑溶液中浸泡消毒5 min，撈出晾干，及時(shí)剔除畸形、弱小植株，采用泥炭土與珍珠巖（體積比2∶1）作為栽培基質(zhì)，植入50孔穴盤(pán)中，擺放在溫室層架上進(jìn)行常規(guī)栽培管理。移栽種植2個(gè)月，成活率達(dá)98.5%（圖4）。

3 討論

鹿角蕨的葉有二型，分為基部盾形葉和孢子葉，基部盾形葉又叫不育葉或營(yíng)養(yǎng)葉，孢子葉又叫可育葉或正常葉（Oliwa et al.，2016），孢子囊散生于孢子葉主裂片第1次分叉的凹缺處以下，初時(shí)綠色，成熟時(shí)棕黃色，每一孢子葉上均密集分布大量孢子，正常條件下，孢子自然萌發(fā)率低，而通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行孢子無(wú)菌萌發(fā)，可加快鹿角蕨繁殖速度，獲得大量組培苗。但由于孢子顆粒極其微小，且裸露于空氣中，如何采取有效消毒方法，避免孢子因被消毒劑殺傷致成活率低下而影響萌發(fā)，即外植體消毒滅菌是否成功是孢子無(wú)菌萌發(fā)至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。酒精和HgCl2是植物組織培養(yǎng)中常用的消毒劑，其中75%酒精比其他濃度的酒精具有更強(qiáng)的殺菌力和穿透力，但不能徹底殺菌，因此常用作表面消毒的第一步，與HgCl2消毒劑配合使用，而HgCl2的使用濃度與消毒時(shí)間掌控較嚴(yán)格，且具有一定毒害作用。此外，超聲波清洗也可進(jìn)行外植體消毒，其原理為超聲波作用于液體中時(shí)，液體中每個(gè)氣泡的破裂會(huì)產(chǎn)生能量極大的沖擊波，相當(dāng)于瞬間產(chǎn)生幾百度的高溫和高達(dá)上千大氣壓，這種現(xiàn)象被稱之為“空化作用”，超聲波清洗正是利用液體中氣泡破裂所產(chǎn)生的沖擊波來(lái)達(dá)到清洗和沖刷工件內(nèi)外表面的作用。本研究結(jié)果表明，采用超聲波清洗器振蕩清洗40 min能達(dá)到理想的消毒效果，污染率僅為6.7%，且孢子萌發(fā)率可達(dá)100.0%，與超聲波處理抱莖獐牙菜種子（張衛(wèi)華和董江澤，2009）及國(guó)槐種子（林海，2011）均能促進(jìn)萌發(fā)的研究結(jié)果相似，說(shuō)明采用超聲波清洗器振蕩清洗能明顯促進(jìn)孢子和種子的萌發(fā)，可能是超聲波的生物學(xué)效應(yīng)發(fā)揮了主要作用，低強(qiáng)度超聲波作用于孢子和種子的細(xì)胞，會(huì)產(chǎn)生胞內(nèi)微流、胞內(nèi)質(zhì)的旋轉(zhuǎn)及渦流運(yùn)動(dòng)，提高細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的穿透性，促進(jìn)了孢子和種子的新陳代謝，從而獲得更多能量使得某些關(guān)鍵酶的活性增強(qiáng)，打破孢子和種子的休眠，促使其萌發(fā)率提高。

鹿角蕨孢子萌發(fā)后形成GGB，類似于蘭花組培中的原球莖，原球莖的增殖可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)蘭花試管苗的大量繁殖，也是各種蘭花開(kāi)展工廠化種苗生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鹿角蕨GGB增殖、芽增殖與生根受培養(yǎng)條件的影響明顯，尤其培養(yǎng)基類型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度、有機(jī)添加物及培養(yǎng)方式等是關(guān)鍵因素。本研究結(jié)果表明，在GGB增殖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，對(duì)GGB增殖起主要作用的是基本培養(yǎng)基，其次是6-BA和CH，NAA對(duì)增殖的影響較小，以改良1號(hào)為基本培養(yǎng)基較好，6-BA適宜濃度為0.5 mg/L，NAA適宜濃度為0.1 mg/L，CH適宜濃度為0.2 g/L，與黃韶玲和張潔蓮（1993）認(rèn)為低濃度激素有利于GGB增殖，高濃度激素不利于GGB生長(zhǎng)的研究結(jié)果一致。在植物組織培養(yǎng)中，基本培養(yǎng)基的選擇是除培養(yǎng)材料外決定培養(yǎng)能否成功的另一個(gè)重要因素。培養(yǎng)基的種類、成分等均直接影響培養(yǎng)材料的生長(zhǎng)發(fā)育，所以應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料的種類和部位，通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比來(lái)篩選適宜的基本培養(yǎng)基。植物激素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育等一系列的生理變化和形態(tài)建成起著控制作用，但作用過(guò)程十分復(fù)雜，并不是某種激素單獨(dú)使用的結(jié)果，而是不同激素在一定條件下相互作用的結(jié)果，因此，需根據(jù)培養(yǎng)材料的特點(diǎn)通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)篩選適宜的激素種類及濃度。此外，培養(yǎng)基配方并非一成不變，其更優(yōu)化的培養(yǎng)方案有待進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

在叢生芽增殖正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，本研究結(jié)果表明，對(duì)鹿角蕨叢生芽增殖起主要作用的是IBA，其次是6-BA和NAA，KT對(duì)叢生芽增殖的影響較小，IBA適宜濃度為0.5 mg/L，6-BA適宜濃度為0.3 mg/L，KT適宜濃度為0.1 mg/L，NAA適宜濃度為0.3 mg/L，與王承義和王穎（2000）認(rèn)為細(xì)胞分裂素6-BA與KT相比，6-BA更有利于芽的分化與增殖的觀點(diǎn)相似，而與黃執(zhí)纓（2004）認(rèn)為KT適宜于二歧鹿角蕨叢生芽誘導(dǎo)的結(jié)果不一致。但對(duì)于IBA對(duì)芽增殖起關(guān)鍵作用的結(jié)果，未見(jiàn)有鹿角蕨組培相關(guān)報(bào)道，IBA促進(jìn)芽增殖，其作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

與常規(guī)酒精與HgCl2配合消毒法相比，超聲波清洗器振蕩清洗40 min能有效降低鹿角蕨孢子污染率，提高孢子萌發(fā)率。鹿角蕨GGB增殖培養(yǎng)基以改良1號(hào)+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+CH 0.2 g/L較適宜，叢生芽增殖培養(yǎng)基以改良2號(hào)+6-BA 0.3 mg/L+KT 0.1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L較適宜，生根培養(yǎng)基以改良1號(hào)+NAA 0.3 mg/L較適宜。

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（責(zé)任編輯 王 暉）

收稿日期：2020-03-03

基金項(xiàng)目：福建省屬公益科研院所基本科研專項(xiàng)（2017R1026-9）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院特色花卉創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（STIT2017-2-9）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，鐘淮欽（1979-），副研究員，主要從事觀賞植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與生物技術(shù)研究工作，E-mail：zhqeeast@163.com。葉秀仙（1977-），副研究員，主要從事花卉育種與組織培養(yǎng)技術(shù)研究工作，E-mail：yxx7861@163.com