牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇的動(dòng)力學(xué)模型

姚鳳騰 董玉瑋

摘要：微生物反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型的建立，能夠在發(fā)酵過(guò)程中放大試驗(yàn)數(shù)據(jù)，提供最佳的控制和模擬，也為分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵的過(guò)渡提供了理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)選擇杏鮑菇菌株，使用牛蒡皮作為基質(zhì)，采用固體發(fā)酵方法培養(yǎng)杏鮑菇菌株，以檢測(cè)菌絲多糖和三萜類化合物的含量。建立了牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇在不同溫度、時(shí)間和限制基質(zhì)條件下的動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)模型參數(shù)進(jìn)行了非線形回歸分析。不同培養(yǎng)時(shí)間下，用Logistic模型擬合杏鮑菇生長(zhǎng)狀況，多糖最高增長(zhǎng)量為0.612 6 mg/（g·d），三萜最高增長(zhǎng)量為0.645 1 mg/（g·d）。在基質(zhì)限定條件下，Logistic模型和統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)方程均能較好擬合。在不同溫度下，Lorentz模型得出多糖增長(zhǎng)量最高時(shí)，最適生長(zhǎng)溫度為28.43 ℃，三萜增長(zhǎng)量最高時(shí)，最適生長(zhǎng)溫度為28.72 ℃。所建數(shù)學(xué)模型能較好地描述實(shí)際的固體培養(yǎng)過(guò)程，為快速有效地采用牛蒡皮固體培養(yǎng)杏鮑菇提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：牛蒡皮;杏鮑菇;動(dòng)力學(xué)模型;固體發(fā)酵;多糖;三萜

中圖分類號(hào)： TS201.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）24-0144-04

牛蒡是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的根莖植物，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括纖維素、胡蘿卜素、蛋白質(zhì)、金屬離子以及多種氨基酸和維生素。牛蒡可供藥食，在所有地下根莖類的蔬菜中，膳食纖維含量是最高的[1]。牛蒡根藥性味苦、性寒、可清熱、祛風(fēng)，可以幫助加快新陳代謝、清除腸胃中殘留的垃圾、促進(jìn)血液的流通、降低膽固醇、降低血糖濃度、防止高血脂和高血壓[2-3]。杏鮑菇（Pleurotus eryngii），因具有杏仁香味和鮑魚(yú)口感而得名，隸屬擔(dān)子菌門、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[4]。杏鮑菇富含蛋白質(zhì)、人體必需的各種氨基酸[5]和極其豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、脂類、多肽、三萜等[6]，具有降血糖、降血脂、增強(qiáng)人體免疫力、美容養(yǎng)顏等功效[7]。

由于牛蒡皮中難以再利用的纖維素含量較高，牛蒡皮通常被當(dāng)作廢棄物丟掉，而微生物尤其是一些藥用真菌如杏鮑菇等，具有分解、利用纖維素的能力。為了充分利用這類廢棄物，本研究以牛蒡皮為固體培養(yǎng)基，精心選取優(yōu)良杏鮑菇菌株，采用固體發(fā)酵技術(shù)，結(jié)合經(jīng)典微生物動(dòng)力學(xué)模型理論，確立多糖和三萜類產(chǎn)量增長(zhǎng)的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型，為以后快速有效地培養(yǎng)杏鮑菇提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。已有10多種方程可用來(lái)描述生物化學(xué)動(dòng)力學(xué)方面的底物變化或生物增長(zhǎng)過(guò)程的變化，例如，Logistic模型是一個(gè)非線性方程，通常用于表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物之間的關(guān)系，并且曲線通常是S形。對(duì)于細(xì)菌的生長(zhǎng)、細(xì)菌濃度的增加和它自己增長(zhǎng)的關(guān)系，可用Logistic模型進(jìn)行擬合，培養(yǎng)時(shí)間不同時(shí)，Logistic模型也具有一定的適用性[8]。然而，每個(gè)方程有自己的缺點(diǎn)，不能被廣泛應(yīng)用到各種領(lǐng)域。如何統(tǒng)一這些方程是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。張艷秋基于酶動(dòng)力學(xué)原理，通過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)，提出了一個(gè)新的基本生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程[9]，幾乎涵蓋了所有現(xiàn)有的動(dòng)力學(xué)方程。這個(gè)方程結(jié)合現(xiàn)有的動(dòng)力學(xué)方程，被稱為統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)方程。目前，對(duì)使用相關(guān)模型，研究食用菌的發(fā)酵過(guò)程還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

這項(xiàng)研究將有助于進(jìn)一步了解發(fā)酵過(guò)程中菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)品形成，以及影響這些產(chǎn)物的環(huán)境因素，并為有效控制菌種的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌種：為筆者實(shí)驗(yàn)室保存的高產(chǎn)多糖菌株;原料：牛蒡由徐州天馬敬安食品有限公司提供;試劑：提取與檢測(cè)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH.B12.601-S-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;FA21240電子天平，精密科學(xué)儀器（上海）有限公司;150B生化培養(yǎng)箱，國(guó)華電器（常州）有限公司;W14646分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司;HH-4恒溫水浴鍋，國(guó)華電器（常州）有限公司;SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司;IXQ-SG45-280A蒸汽滅菌鍋，上海訊博實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;FSD-101A電動(dòng)粉碎機(jī)，新恩精密糧儀（臺(tái)州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制 PDA 培養(yǎng)基：去皮甘薯 200 g/L，瓊脂 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酵母膏 3 g/L，KH2PO4 3 g/L，少量維生素B1。

1.3.2 杏鮑菇菌種的活化 先配制PDA 培養(yǎng)基，然后活化杏鮑菇菌種，28 ℃下培養(yǎng) 7 d。

1.3.3 固體發(fā)酵培養(yǎng)杏鮑菇

1.3.3.1 培養(yǎng)溫度 粉碎牛蒡皮至5 mm長(zhǎng)度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，分別在22、25、28、31 ℃下培養(yǎng)15～20 d，至菌絲體鋪滿培養(yǎng)基，菌絲體于60 ℃烘箱中烘干備用。

1.3.3.2 培養(yǎng)時(shí)間 粉碎牛蒡皮至5 mm長(zhǎng)度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21天，對(duì)菌絲體進(jìn)行多糖和三萜的提取和測(cè)定。

1.3.3.3 培養(yǎng)基質(zhì) 粉碎牛蒡皮至5 mm長(zhǎng)度，以20 g/250 mL為裝瓶量，將牛蒡皮裝入瓶中，高壓滅菌20 min。將已活化的杏鮑菇菌種轉(zhuǎn)接于牛蒡皮固體培養(yǎng)基中，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第3天起，每隔6 h或12 h取出，對(duì)菌絲體進(jìn)行多糖和三萜的提取和測(cè)定。

1.3.4 杏鮑菇多糖的提取與測(cè)定[10-11]

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取無(wú)水葡萄糖0.500 0 g，至100 mL容量瓶稀釋定容，取溶液1 mL于50 mL容量瓶，定容。 2.50 mL容量瓶中分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，至試管，每樣平行3次，分別加入2 mL的蒸餾水、1 mL的6%苯酚和 5 mL 的濃硫酸，混勻，放在沸水浴中加熱15 min，然后冷卻。分光光度計(jì)測(cè)量490 nm處的吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.014 5x+0.014 7，r2=0.992 9。

1.3.4.2 提取方式 首先用熱水溶解。粉碎子實(shí)體，按照 1 g 子實(shí)體10 mL 純水的比例，在 40 ℃水浴鍋溶解過(guò)夜，離心取其上清液，離心條件設(shè)置為 4 000 r/min，離心時(shí)間 5 min。加入上清液5 倍體積的95%乙醇，靜置過(guò)夜，取出后4 000 r/min，離心 5 min，棄上清，沉淀為粗多糖。

1.3.4.3 測(cè)定方法 粗多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法。先將多糖樣品加水定容 100 mL，取 2 mL 待測(cè)樣品放在試管中，加 1 mL 濃度為 6% 苯酚，5 mL 濃硫酸，充分搖勻，靜置 5 min，放入 100 ℃水浴鍋中水浴15min，冷水冷卻，490 nm下測(cè)定吸光度，按上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算粗多糖含量。

1.3.5 三萜的提取與檢測(cè)[12]

1.3.5.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取干凈試管7支，分別取20、40、60、80、100、120、140 μg的齊墩果酸，放入試管內(nèi)。向7支試管中加入現(xiàn)配制的0.3 mL香草醛和1.0 mL高氯酸，振蕩混勻，60 ℃水浴20 min，冷卻 15 min，再加入5 mL冰醋酸，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.004 9x-0.009 2，r2=0.998 3。

1.3.5.2 提取方式 取烘干后菌絲體粉碎，取1 g于燒杯中，加50 mL甲醇，靜置，溶解過(guò)夜。過(guò)濾溶解液，60 ℃水浴加熱，直至蒸干液體，再倒入40 mL無(wú)水乙醇至燒杯中，使其溶解。

1.3.5.3 測(cè)定方法 三萜檢測(cè)采用香草醛-高氯酸比色法。取溶解液1 mL至試管中，依次加入 2 mL 5%香草醛、5 mL高氯酸，混合均勻之后，在 60 ℃ 水浴20 min，冷卻15 min，加入冰醋酸5 mL，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0 軟件處理數(shù)據(jù)、方程擬合并作圖，所有數(shù)據(jù)用x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖和三萜類增長(zhǎng)量隨溫度變化的模型

杏鮑菇多糖和三萜增長(zhǎng)量會(huì)隨溫度變化，采用Origin 9.0軟件中的Lorentzian 模型，對(duì)測(cè)定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，在28 ℃時(shí)，杏鮑菇多糖和三萜增長(zhǎng)率最高，小于或大于28 ℃時(shí)，杏鮑菇多糖、三萜增長(zhǎng)率會(huì)下降，說(shuō)明在28 ℃是杏鮑菇生長(zhǎng)最旺盛。由圖1可知，杏鮑菇的最適生長(zhǎng)溫度為28.43 ℃（r2=0.997 4），實(shí)際培養(yǎng)最佳溫度為 28 ℃，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近。參數(shù)估計(jì)為：y0=-3.340 7，x0=28.428 8，w=51.003 7，A=297.025 2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P=0.009 29<0.05，說(shuō)明用自變量預(yù)測(cè)因變量結(jié)果可信;F=6 256.9遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)間的差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此不同溫度下多糖產(chǎn)量增長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程可以用該方程描述。

由圖2可知，杏鮑菇的最適生長(zhǎng)溫度為 28.72 ℃（r2=0.990 2），實(shí)際培養(yǎng)最佳溫度為 28 ℃，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值非常接近。參數(shù)估計(jì)為：y0=0.609 2，x0=28.716 4，w=6.348 5，A=3.342 6。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P=0.003 15<0.05，說(shuō)明用自變量預(yù)測(cè)因變量結(jié)果可信;F=54 578.2遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)間的差異極顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此可以用該方程描述不同溫度下多糖含量的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。推測(cè)當(dāng)溫度≤25 ℃時(shí)，酶活性較低，多糖與三萜的合成途徑受到抑制;溫度≥31 ℃，酶失活，多糖與三萜合成途徑受到抑制;28 ℃左右，酶活性較高，多糖與三萜產(chǎn)量增高。

2.2 多糖和三萜類增長(zhǎng)量隨時(shí)間變化的模型

杏鮑菇多糖和三萜增長(zhǎng)量會(huì)隨時(shí)間變化，采用Origin 9.0軟件中的Logistic模型，對(duì)測(cè)定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4。

從圖3、圖4可以看出，在發(fā)酵前6 d，菌絲體處于生長(zhǎng)適應(yīng)期，長(zhǎng)勢(shì)較慢;第6～15天，菌絲體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，呈幾何數(shù)增長(zhǎng);發(fā)酵第15～21天，菌絲體處于穩(wěn)定期，生長(zhǎng)速率下降，并逐漸趨于平緩。從圖3可看出，Logistic模型相關(guān)系數(shù)r2為 0.996 5，達(dá)極顯著水平，概率值P<0.01，說(shuō)明擬合方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)很吻合，F(xiàn)=2 2937.7，遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)間存在極顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以使用此模型模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇生成多糖的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

從圖4可看出，Logistic模型擬合出的曲線相關(guān)系數(shù)r2為0.999 6，達(dá)極顯著水平，概率值P<0.01，說(shuō)明擬合方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)很吻合，F(xiàn)=707 008.1，遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)間存在極顯著差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以使用此模型模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇合成三萜的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

2.3 限定基質(zhì)對(duì)多糖和三萜類增長(zhǎng)量的影響

限定基質(zhì)下測(cè)得杏鮑菇多糖和三萜增長(zhǎng)量，采用Origin 9.0軟件中的Logistic模型，對(duì)測(cè)定的多糖和三萜數(shù)據(jù)分別進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

從圖5可以看出，采用Logistic模型擬合的相關(guān)系數(shù)r2為0.995，達(dá)顯著水平，F(xiàn)值遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)之間存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)模型擬合的曲線的相關(guān)系數(shù)r2為0.980，達(dá)到顯著水平，F(xiàn)遠(yuǎn)大于1，說(shuō)明擬合的方程與試驗(yàn)的數(shù)據(jù)點(diǎn)也較吻合，也可以使用統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)方程模擬杏鮑菇的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。

從圖6可以看出，用Logistic模型擬合出的相關(guān)系數(shù)r2為0.994，達(dá)顯著水平，F(xiàn)大于1，說(shuō)明各組數(shù)據(jù)間存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，用統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)方程擬合的曲線的相關(guān)系數(shù)r2為0.949，達(dá)顯著水平，F(xiàn)大于1，說(shuō)明擬合方程與試驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)較吻合，可以使用統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)方程模擬牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇產(chǎn)生三萜的增長(zhǎng)量。由圖5、圖6擬合模型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)比較，Logistic模型擬合的效果較統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)模型要好，因此可以用Logistic模型擬合在有限的基質(zhì)條件下牛蒡皮固體發(fā)酵杏鮑菇生長(zhǎng)所產(chǎn)生的多糖和三萜增長(zhǎng)量。

3 結(jié)論

根據(jù)不同溫度下多糖和三萜類含量增長(zhǎng)率的測(cè)定結(jié)果，采用Lorentz方程擬合，最適生長(zhǎng)溫度分別為28.43 ℃和28.72 ℃。根據(jù)多糖和三萜類含量增長(zhǎng)率隨培養(yǎng)時(shí)間變化的測(cè)定結(jié)果，采用Logistic模型擬合，菌絲體生長(zhǎng)第6～15 d，多糖和三萜類含量增長(zhǎng)速度最快。根據(jù)限定基質(zhì)條件下菌絲體多糖、三萜類的增長(zhǎng)率，采用Logistic模型和統(tǒng)一動(dòng)力學(xué)模型同時(shí)擬合，由擬合結(jié)果可知，相比動(dòng)力學(xué)模型，Logistic模型擬合效果更好，具有更高的準(zhǔn)確性，對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和反應(yīng)狀況具有指導(dǎo)意義。

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