素馨屬植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

荊玲俠 卜朝陽 崔學(xué)強(qiáng) 狄清琳 盧家仕

摘要：為了確定素馨屬植物ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，以素馨屬植物葉片為材料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)2種方法對(duì)影響素馨屬ISSR-PCR反應(yīng)中的dNTPs 、Taq DNA聚合酶、引物、模板 DNA以及Mg2+ 5個(gè)因素進(jìn)行4個(gè)水平的優(yōu)化試驗(yàn)，通過試驗(yàn)建立了素馨屬25 μL最佳反應(yīng)體系：dNTPs濃度為0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度為0.7 μmol/L、模板 DNA用量為2.5 ng、Mg2+濃度為1.0 mmol/L。在最佳反應(yīng)體系下，從100條ISSR引物中篩選出了8條ISSR引物，并確定了各引物的最佳退火溫度。利用29份素馨屬材料進(jìn)行最佳反應(yīng)體系的驗(yàn)證，結(jié)果表明，該優(yōu)化體系擴(kuò)增條帶清晰，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，表明該反應(yīng)體系適用于素馨屬植物ISSR分子標(biāo)記的研究。本研究可為素馨屬植物遺傳多樣性以及親緣關(guān)系等方面的研究提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：素馨屬;ISSR-PCR;單因素試驗(yàn);正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)： S684.01;S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）23-0071-08

素馨屬（Jasminum）隸屬于木樨科（Oleaceae）素馨亞科（Jasminoideae），該屬植物枝葉繁茂，花形優(yōu)美，且多具芳香性，不乏觀賞價(jià)值較高的植物[1]。目前，素馨屬在我國(guó)有47種、1個(gè)亞種、4個(gè)變種，該屬植物主要包括多種素馨、毛茉莉和茉莉花[2-3]。

目前，有關(guān)素馨屬植物分子方面的研究仍然比較欠缺。劉忠等利用TRAP技術(shù)對(duì)采自廣西周邊地區(qū)的28份茉莉種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性研究，并利用聚類分析將這28份茉莉材料聚為5個(gè)類群[4]。邱長(zhǎng)玉等從100個(gè)ISSR隨機(jī)引物中篩選出10個(gè)多態(tài)性引物對(duì)廣西橫縣境內(nèi)的30份茉莉花材料進(jìn)行了研究[5]。此外，陳笛等利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)茉莉花萜類香氣物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行擴(kuò)增，以研究其在茉莉花開放過程中的表達(dá)情況[6-7]。胥愛麗等對(duì)扭肚藤進(jìn)行了UPLC指紋圖譜的建立[8]。總體來說，素馨屬植物在分子方面的研究還不夠深入。

ISSR 標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了SSR和RAPD 2種標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但其最關(guān)鍵的步驟是要針對(duì)不同的物種建立相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系[9]。目前，ISSR分子標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于郁金香[10]以及荷花[11]等觀賞性園藝植物的品種鑒定以及遺傳多樣性分析中。ISSR技術(shù)是基于PCR的一種分子標(biāo)記技術(shù)，其擴(kuò)增結(jié)果易受dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA濃度等因子的影響[12]。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法來優(yōu)化 ISSR-PCR 反應(yīng)中的各項(xiàng)因子，建立適用于素馨屬ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系，為進(jìn)一步開展素馨屬植物的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析等方面的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試素馨屬材料采自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所資源圃。8條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物均來自于哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia， UBC）公布的100條ISSR通用引物。這8條引物分別為807（AGAGAGAGAGAGAGAGT）、811（DAGAGAGAGAGAGAGAC）、822（TCTCTCTCTCTCTCTCA）、834（AGAGAGAGAGAGAGAGYT）、835（AGAGAGAGAGAGAGAGYC）、841（GAGAGAGAGAGAGAGAYC）、873（GACAGACAGACAGACAGACA）、881（GGGTGGGGTGGGGTG），均用于后續(xù)PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建。本研究所用引物由上海生物工程股份有限公司合成，所用試劑dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、Marker等均采自東盛生物科技有限公司，其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試材料DNA 提取與檢測(cè) 以供試材料的葉片為材料，使用天根植物快速DNA提取試劑盒法，對(duì)供試材料的葉片進(jìn)行DNA提取。DNA提取后用1.00%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系單因素篩選試驗(yàn) 對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系中的dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+ 濃度5個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)中，在對(duì)某一因素進(jìn)行梯度優(yōu)化時(shí)，保持其他4個(gè)因素不變。20個(gè)處理（表1）的PCR反應(yīng)體系的總體積均為25 μL，每個(gè)處理重復(fù)2次。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 4 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共計(jì)35個(gè)循環(huán); 最后 72 ℃ 10 min。 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+ 濃度進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)化處理。針對(duì)上述因素采用5因素4水平L16（45）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2、表3）。試驗(yàn)按照表3中的16個(gè)處理水平進(jìn)行試驗(yàn)，各個(gè)處理水平PCR反應(yīng)體系的總體積均為25 μL，每個(gè)處理水平重復(fù)2次。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min;94 ℃ 4 min，54 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 引物及其退火溫度的篩選 本研究在已確定的最佳素馨屬ISSR-PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)引物退火溫度進(jìn)行篩選，以各引物的Tm值為中間溫度，使用溫度梯度PCR儀自動(dòng)形成的12個(gè)溫度梯度來篩選不同引物的最佳退火溫度。

1.2.5 ISSR-PCR最佳體系的驗(yàn)證 ISSR-PCR 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化結(jié)果應(yīng)經(jīng)過不同供試材料的反復(fù)驗(yàn)證以確定該擴(kuò)增體系的可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 dNTPs濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響 根據(jù)需求本研究設(shè)置了4個(gè)dNTPs濃度梯度，分別為0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L，每個(gè)濃度梯度重復(fù)試驗(yàn)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，在dNTPs濃度為0.10～0.15 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶基本一致且清晰，并可以看出，在濃度為 0.10 mmol/L 時(shí)，擴(kuò)增條帶最亮最清晰。在dNTPs濃度為0.20～0.25 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較暗且不完全。因此，在本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系單因素篩選中dNTPs的最適濃度為0.10 mmol/L。

2.1.2 Taq DNA聚合酶用量對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響 根據(jù)需求本研究設(shè)置了4個(gè)Taq DNA聚合酶用量梯度，分別為1.0、1.5、2.0、2.5 U，每個(gè)用量梯度重復(fù)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖2。其中，在Taq DNA聚合酶的用量為1.0 U時(shí)，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生。在Taq DNA聚合酶的用量為 1.5 U 時(shí)，擴(kuò)增條帶較暗且不完全。在Taq DNA聚合酶的用量為2.0～2.5 U時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且基本一致，擴(kuò)增產(chǎn)物間沒有明顯差異?；诔杀究紤]，本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系單因素篩選中Taq DNA聚合酶的最適用量為2.0 U。

2.1.3 引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響 根據(jù)需求本研究設(shè)置了4個(gè)引物濃度梯度，分別為0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L，每個(gè)濃度梯度重復(fù)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)引物濃度為0.2 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較暗且不完全。隨著引物濃度的增加，擴(kuò)增條帶逐漸清晰，在引物濃度為0.8 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰。因此，本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系單因素篩選中引物的最適濃度為0.8 μmol/L。

2.1.4 模板DNA用量對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響 根據(jù)需求本研究設(shè)置了4個(gè)用量梯度，分別為2.0、2.5、3.0、3.5 ng，每個(gè)用量梯度重復(fù)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，當(dāng)模板DNA用量在2.0～3.0 ng之間時(shí)，擴(kuò)增條帶間沒有明顯差異。當(dāng)模板DNA濃度為 3.5 ng 時(shí)，產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增條帶。因此，本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系單因素篩選中模板DNA用量的最適范圍為2.0～3.0 ng。

2.1.5 Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增體系的影響 根據(jù)需求本研究設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，分別為0.9、1.2、1.5、1.8 mmol/L，每個(gè)濃度梯度重復(fù)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，當(dāng)Mg2+濃度在0.9～1.2 mmol/L之間時(shí)，擴(kuò)增條帶較暗且數(shù)量比較少。當(dāng)Mg2+ 濃度為1.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶比較清晰。當(dāng)Mg2+濃度為1.8 mmol/L時(shí)，非特異性擴(kuò)增數(shù)量增加。因此，本研究ISSR-PCR擴(kuò)增體系單因素篩選中Mg2+ 濃度的最適濃度為1.5 mmol/L。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

根據(jù)表3的16個(gè)處理組合，每個(gè)處理組合重復(fù)試驗(yàn)2次，具體擴(kuò)增結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，16個(gè)正交處理組合中的第8個(gè)處理組合為最佳處理組合。該處理組合比其他處理組合擴(kuò)增條帶更加清晰，擴(kuò)增數(shù)量也更加豐富。因此本研究中 25 μL 最佳素馨屬植物基因組ISSR-PCR擴(kuò)增體系為dNTPs濃度0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度0.7 μmol/L、模板DNA用量2.5 ng、Mg2+ 濃度1.0 mmol/L。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖直觀評(píng)分

根據(jù)圖6的電泳結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增條帶的數(shù)量、強(qiáng)弱和清晰度采用直觀評(píng)分的方式對(duì)16個(gè)正交設(shè)計(jì)處理水平的電泳結(jié)果從高到低進(jìn)行打分，條帶數(shù)量豐富、亮度和清晰度高的處理記為16分，相反，最差的記為1分[13]。針對(duì)16個(gè)正交處理水平的2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)分，評(píng)分的結(jié)果分別為9、10、15、7、3、9、14、15、7、10、2、9、4、6、12、11;10、9、15、6、3、10、13、16、8、9、1、8、3、6、11、11。

利用SPSS 22.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)16個(gè)正交處理水平的2次重復(fù)結(jié)果的評(píng)分進(jìn)行方差分析（表4）。從表4中可以看出，各因素水平的影響均達(dá)到了極顯著水平，且從大到小依次為Mg2+濃度>Taq DNA 聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA用量。

2.4 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素內(nèi)各處理水平對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

由于各因素水平間的差異均達(dá)到了極顯著水平，所以需要進(jìn)一步對(duì)各因素內(nèi)不同處理水平作多重比較分析。

2.4.1 dNTPs濃度對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響 對(duì)dNTPs各處理水平梯度的多重比較分析結(jié)果表明，各處理水平梯度間均差異不顯著。從圖7可以看出，隨著dNTPs濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增大后降低再增大的趨勢(shì)。當(dāng)dNTPs濃度在0.05～0.10 mmol/L時(shí)，反應(yīng)結(jié)果均值隨著dNTPs濃度的增加而增大，在0.10 mmol/L時(shí)，達(dá)最大值;當(dāng)dNTPs濃度繼續(xù)增加時(shí)，結(jié)果均值逐漸降低，在0.15 mmol/L時(shí)最小;隨著dNTPs濃度繼續(xù)的增加，結(jié)果均值繼續(xù)增大。因此，在25 μL反應(yīng)體系中選擇0.10 mmol/L水平作為該研究PCR反應(yīng)體系中dNTPs的最佳濃度。

2.4.2 Taq DNA聚合酶用量對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響 對(duì)Taq DNA聚合酶用量各處理水平梯度的多重比較分析結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶用量梯度1.0 U與2.0 U和2.5 U之間差異顯著，P值均達(dá)到0.024，其他各處理水平梯度間差異不顯著。從圖8可以看出，隨著Taq DNA聚合酶用量的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增大后降低再增大的趨勢(shì)。當(dāng)Taq DNA聚合酶用量在1.0～1.5 U時(shí)，結(jié)果均值隨著Taq DNA聚合酶用量的增加而增大;當(dāng)Taq DNA聚合酶用量繼續(xù)增加時(shí)，結(jié)果均值逐漸降低，在2.0 U時(shí)最小;隨著Taq DNA聚合酶用量的繼續(xù)增加，結(jié)果均值增大，在2.5 U時(shí)結(jié)果均值為最大。因此，在 25 μL 反應(yīng)體系中選擇2.5 U水平作為該研究PCR反應(yīng)體系中Taq DNA聚合酶的最佳用量。

2.4.3 引物濃度對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響 通過對(duì)引物各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出各處理水平梯度間均差異不顯著。從圖9可以看出，隨著引物濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)引物濃度在0.3～0.7 μmol/L時(shí)，反應(yīng)結(jié)果均值隨著引物濃度的增加而增大，在 0.7 μmol/L 時(shí)最大;當(dāng)引物濃度繼續(xù)增加時(shí)，結(jié)果均值逐漸降低。因此，在25 μL反應(yīng)體系中選擇0.7 μmol/L水平作為該研究PCR反應(yīng)體系中引物的最佳濃度。

2.4.4 Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響 通過對(duì)因素Mg2+ 各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出1.0、1.5、2.0 mmol/L水平間差異不顯著，三者均與2.5 mmol/L水平間呈現(xiàn)出差異顯著的關(guān)系。從圖10可以看出，隨著Mg2+ 濃度的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。當(dāng)Mg2+ 濃度在1.0 mmol/L時(shí)，反應(yīng)結(jié)果均值最大。因此，在25 μL反應(yīng)體系中選擇最大值1.0 mmol/L水平作為該研究PCR反應(yīng)體系中Mg2+ 的最佳濃度。

2.4.5 模板DNA用量對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響 通過對(duì)模板DNA各處理水平梯度的多重比較分析，可以看出各處理水平梯度間差異均不顯著。從圖11可以看出，隨著DNA用量的增加，結(jié)果均值呈現(xiàn)先降低后增加再降低的趨勢(shì)，但總體呈現(xiàn)比較平穩(wěn)的狀態(tài)，這一結(jié)論與謝運(yùn)海等研究結(jié)果[14]類似。因此，在25 μL反應(yīng)體系中選擇2.0～3.5 ng模板DNA用量均可。

2.5 引物及其退火溫度的篩選

引物的退火溫度是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的一個(gè)重要因子。本研究利用已確定的最佳素馨屬 ISSR-PCR 反應(yīng)體系，從100條ISSR引物中篩選出8條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物。以引物的Tm值作為中間溫度，使用溫度梯度PCR儀自動(dòng)形成的12個(gè)溫度梯度來篩選不同引物的最佳退火溫度，每個(gè)溫度梯度設(shè)置2個(gè)重復(fù)（圖12）。各引物的溫度梯度、Tm值和篩選后的最適溫度見表5。

2.6 優(yōu)化后ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測(cè)

以29份素馨屬材料DNA為樣本，用引物822和引物807來檢測(cè)最佳PCR反應(yīng)體系組合8（表3）穩(wěn)定性（圖13、圖14）。結(jié)果表明，該擴(kuò)增體系是穩(wěn)定可靠的，適用于素馨屬植物基因組ISSR分子標(biāo)記的擴(kuò)增，可為素馨屬植物的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)因具有高多態(tài)性、穩(wěn)定性、操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于許多物種的遺傳鑒定研究中。但由于物種或試驗(yàn)條件的差異，PCR擴(kuò)增結(jié)果也會(huì)存在一定程度的差異。本研究利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合的方法，針對(duì)影響ISSR-PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、Taq DNA 聚合酶用量、引物濃度、模板DNA用量以及Mg2+濃度5個(gè)因素建立了適用于素馨屬植物的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系（25 μL）：dNTPs濃度為0.10 mmol/L、Taq DNA 聚合酶用量為2.5 U、引物濃度為0.7 μmol/L、模板DNA含量為2.5 ng、Mg2+ 濃度為1.0 mmol/L。

通過對(duì)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖的直觀評(píng)分，可知各因素對(duì)PCR擴(kuò)增體系的影響程度從大到小依次為Mg2+ 濃度>Taq DNA 聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA用量，并且各因素對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響均達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。

研究發(fā)現(xiàn)，Taq DNA聚合酶的用量過多或者過少都不利于PCR擴(kuò)增程序的進(jìn)行。用量過少會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)展產(chǎn)物不足，用量過多不僅易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的增加還會(huì)增加試驗(yàn)成本[15]。本研究中Taq DNA聚合酶最適用量與王佳等的研究結(jié)果[16-17]一致，均為2.5 U。

dNTPs濃度過低影響擴(kuò)增效率，濃度過高可能導(dǎo)致PCR錯(cuò)配甚至產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。本研究中確定dNTPs最適濃度為0.10 mmol/L，本研究dNTPs濃度與盧莉等的研究結(jié)果[18-19]是相近的。

引物濃度與DNA模板用量的結(jié)合緊密程度存在相關(guān)性。當(dāng)模板DNA用量一定時(shí)，引物濃度過高，可能引起堿基間的錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量的下降，并可能出現(xiàn)Smear現(xiàn)象[20]。本研究中確定引物最適濃度為 0.7 μmol/L。本研究結(jié)果與朱頂紅等物種研究中確定的最適引物濃度[21-22]相近。

DNA 模板質(zhì)量是確保ISSR-PCR順利有效擴(kuò)增的重要因素之一。模板用量的最適范圍取決于所研究的物種和模板的純度。本研究確定模板用量是對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果影響最小的一個(gè)因素，并確定了DNA模板最適用量為2.5 ng。本結(jié)果與謝運(yùn)海等的研究結(jié)果[14，23]存在一致性。

Mg2+ 濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和擴(kuò)增產(chǎn)量有顯著的影響。Mg2+濃度過高，會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，濃度過低，會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，從而降低了擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。本研究Mg2+濃度是對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最大的一個(gè)因素，這與錢志瑤等的研究結(jié)果[24-25]存在一致性;并確定了Mg2+最適濃度為1.0 mmol/L，這與肖琳等的研究結(jié)果[26]一致。

從正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳圖的結(jié)果中可以看出，16個(gè)正交處理水平的第8個(gè)處理組合為最佳處理組合。該組合（25 μL）各因素濃度或用量分別為dNTPs濃度0.10 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量2.5 U、引物濃度0.7 μmol/L、模板DNA用量2.5 ng、Mg2+ 濃度1.0 mmol/L，與正交試驗(yàn)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖直觀評(píng)分結(jié)果的方差分析和多重比較分析得到的各因素最佳用量一致。綜上所述，不同物種ISSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果具有不同程度的差異。本研究通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化ISSR-PCR反應(yīng)體系中的5個(gè)影響因子，建立了適用于素馨屬植物ISSR-PCR反應(yīng)的最佳體系，通過對(duì)該體系的驗(yàn)證，結(jié)果表明該體系具有很好的穩(wěn)定性、可重復(fù)性，可為素馨屬種質(zhì)遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系的研究鑒定等方面提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]付 影. 素馨屬植物資源及其在園林中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（2）：195-196， 201.

[2]周錦業(yè)，宋 倩，李春牛，等. 基于廣西茉莉產(chǎn)業(yè)的農(nóng)業(yè)科普教育分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（5）：121-124.

[3]韋仲新，周浙昆，白佩瑜. 素馨屬植物花粉形態(tài)的研究[J]. 云南植物研究，1988（3）：271-279.

[4]劉 忠，楊 波，楊玉國(guó)，等. 28份茉莉花種質(zhì)基于TRAP技術(shù)的遺傳多樣性分析[J]. 分子植物育種，2017，15（1）：364-369.

[5]邱長(zhǎng)玉，高國(guó)慶，陳伯倫，等. 茉莉花ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J]. 北方園藝，2008（2）：214-217.

[6]陳 笛，王鵬杰，鄭玉成，等. 茉莉花磷酸甲羥戊酸激酶基因克隆及表達(dá)分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（10）：1909-1916.

[7]熊 青，宋姣敏，崔 萌，等. 茉莉花JsPAL2基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（7）：1359-1366.

[8]胥愛麗，畢曉黎，劉布鳴，等. 扭肚藤UPLC指紋圖譜建立及2種成分測(cè)定[J]. 中成藥，2018，40（3）：632-637.

[9]代培紅，朱 瑜，姚正培，等. 葡萄種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，44（8）：1258-1262.

[10]巨秀婷，阿啟蘭，侯志強(qiáng)，等. 基于ISSR分子標(biāo)記的郁金香品種遺傳多樣性分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（7）：2934-2939.

[11]何天友，沈少炎，瞿印權(quán)，等. 基于ISSR標(biāo)記的20種荷花品種資源遺傳多樣性分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（6）：128-132.

[12]王彥華，侯喜林，徐明宇.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化不結(jié)球白菜ISSR反應(yīng)體系研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2004，24（5）：899-902.

[13]何正文，劉運(yùn)生，陳立華，等. 正交設(shè)計(jì)直觀分析法優(yōu)化PCR條件[J]. 湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，23（4）：403-404.

[14]謝運(yùn)海，夏德安，姜 靜，等. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化水曲柳ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 分子植物育種，2005，3（3）：445-450.

[15]劉曉靜，王文泉，郭凌飛.益智ISSR-PCR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)，2008，18（3）：33-37.

[16]王 佳，胡永紅，張啟翔 .牡丹ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化設(shè)計(jì)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（24）：6465-6466， 6484.

[17]關(guān) 錳，白成科，王喆之. 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化山茱萸ISSR-PCR反應(yīng)體系研究[J]. 陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，36（2）：80-84.

[18]盧 莉. 武陵山區(qū)茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的ISSR分析[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[19]劉 峰，顧志敏，陳析豐，等. 長(zhǎng)春花ISSR-PCR 反應(yīng)體系的正交優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（5）：2261-2263， 2267.

[20]Sobral B W S， Honeycutt R J. High output genetic mapping of polyploids using PCR-generated markers[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1993， 86（1）： 105-112.

[21]張 林. 基于形態(tài)性狀和ISSR標(biāo)記的朱頂紅品種遺傳多樣性分析及ISSR指紋圖譜構(gòu)建[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[22]趙麗華. 石榴ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[J]. 北方園藝，2010（19）：148-152.

[23]曾艷玲，譚曉風(fēng)，曾曉峰. 采用正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化梨ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（11）：1235-1238.

[24]錢志瑤，周道堂，黃秀平，等. 黔產(chǎn)寬葉纈草ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2015，31（7）：69-75.

[25]盧 莉，張 強(qiáng)，王玉花，等. 利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化茶樹ISSR反應(yīng)體系[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2010，28（1）：14-19.

[26]肖 琳，曾艷玲，劉衛(wèi)東. 采用正交設(shè)計(jì)方法優(yōu)化觀賞桃ISSR-PCR反應(yīng)體系[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究，2017，35（4）：136-140.朱海榮. 糧豆輪作下土壤培肥及養(yǎng)分管理對(duì)玉米鐵研58生長(zhǎng)生理及產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（23）：79-83.