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    醒腦靜注射液對MCAO大鼠神經(jīng)功能、神經(jīng)細胞炎癥及氧化應激損傷的影響

    2020-02-22 07:29王振鳳田克姚劉南海
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2020年36期
    關鍵詞:醒腦靜注射液炎癥反應凋亡

    王振鳳 田克姚 劉南海

    [摘要] 目的 研究醒腦靜注射液對大腦中動脈阻塞大鼠神經(jīng)功能、神經(jīng)細胞炎癥及氧化應激損傷的影響。 方法 選擇SD雄性大鼠并隨機分為SHAM組、MCAO組、醒腦靜組,用線栓法建立MCAO模型后,醒腦靜組給予醒腦靜注射液干預,SHAM組和MCAO組給予生理鹽水干預。比較三組間神經(jīng)功能缺損評分、腦缺血組織細胞凋亡率、炎癥指標及氧化應激指標的差異。 結(jié)果 MCAO組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分、腦缺血組織細胞凋亡率、腦缺血組織中NF-κB的表達水平和NOX4的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1、ROS、MDA的含量均明顯高于SHAM組,T-AOC的含量明顯低于SHAM組;醒腦靜組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分、腦缺血組織細胞凋亡率、腦缺血組織中NF-κB的表達水平和NOX4的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1、ROS、MDA的含量均明顯低于MCAO組,T-AOC的含量明顯高于MCAO組。 結(jié)論 醒腦靜注射液能夠改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能,且這一改善作用與神經(jīng)細胞炎癥及氧化應激損傷受抑制有關。

    [關鍵詞] 腦梗死;大腦中動脈阻塞;醒腦靜注射液;凋亡;炎癥反應;氧化應激反應

    [中圖分類號] R743.3;R741.05? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701(2020)36-0036-04

    [Abstract] Objective To study the effects of Xingnaojing Injection on nerve function, nerve cell inflammation and oxidative stress injury(OSI) in rats with middle cerebral artery occlusion. Methods SD male rats were selected and randomly divided into the SHAM group, the MCAO group and the Xingnaojing group. After MCAO model was established by suture-occluded method, Xingnaojing group was given Xingnaojing injection, while Sham group and MCAO group were given normal saline. The neurological deficit score, apoptosis rate of ischemic brain tissue, inflammation index and oxidative stress index were compared among the three groups. Results The neurological deficit score, apoptosis rate, expression levels of NF-κB and NOX4, and contents of IL-1β, TNF-α, MMP-9, ICAM-1, ROS and MDA in MCAO group were significantly higher than those in SHAM group, while the content of T-AOC was significantly lower than that in SHAM group. In the Xingnaojing group, the neurological deficit score, the apoptosis rate in cerebral ischemia tissue, the expression levels of NF-κB and NOX4 in cerebral ischemia tissue and the contents of IL-1β, TNF-α, MMP-9, ICAM-1, ROS and MDA were significantly lower than those in MCAO group. The content of T-AOC was significantly higher than that in MCAO group. Conclusion Xingnaojing injection can improve the nerve function of MCAO rats, and this improvement is related to the inhibition of nerve cell inflammation and OSI.

    [Key words] Cerebral infarction; Middle cerebral artery occlusion; Xingnaojing injection; Apoptosis; Inflammatory reaction; Oxidative stress reaction

    急性腦梗死是威脅人類健康及生命的常見心腦血管疾病之一,具有較高的致死率和致殘率[1-2],探尋能夠保護腦組織、減輕神經(jīng)損傷的藥物一直是相關領域的研究熱點。醒腦靜注射液是根據(jù)安宮牛黃丸組方精制而成的靜脈注射液,其有效成分包括麝香、冰片、梔子等,現(xiàn)代藥理學研究證實,醒腦靜注射液中的多種成分具有抗炎、抗氧化等活性,進入體內(nèi)能夠發(fā)揮腦保護作用。國內(nèi)已有臨床研究證實,醒腦靜注射液用于治療腦梗死患者能夠改善神經(jīng)功能[3-4],但醒腦靜注射液是否在腦梗死的治療中起到抗炎、抗氧化作用仍未明確。為了探明醒腦靜注射液用于腦梗死治療的價值及分子機制,本研究以大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠作為實驗對象,具體分析醒腦靜注射液對MCAO大鼠神經(jīng)功能、神經(jīng)細胞炎癥及氧化應激損傷的影響,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料來源

    1.1.1 動物? 廣東省醫(yī)學實驗動物中心采購的SD雄性大鼠作為實驗動物,SPF級,體重250~280 g,許可證號SYXK桂2016-0003。

    1.1.2 試劑? 醒腦靜注射液購自河南天地藥業(yè)公司,TUNEL試劑盒、蛋白裂解液購自上海碧云天公司,Western-blot檢測所用核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)第一抗體購自Abcam公司,酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)公司,化學熒光法試劑盒、硫代巴比妥酸法試劑盒、比色法試劑盒購自南京建成研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組及干預方法? 實驗動物隨機分為SHAM組、MCAO組、醒腦靜組,每組各12只。MCAO組和醒腦靜組采用線栓法建立MCAO模型:腹腔注射10%水合氯醛麻醉后,仰臥位固定,做頸正中切口后分離右側(cè)頸總動脈(Common carotid artery,CCA)、頸外動脈(External carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動脈(Internal carotid artery,ICA),將ECA用縫線結(jié)扎并離斷,將CCA的近端結(jié)扎,遠端用動脈夾夾閉,在CCA的主干做一小切口,將尼龍線栓經(jīng)切口插入后移去CCA上的動脈夾,將線栓緩慢向內(nèi)推進,遇到阻力時停止并向后退回約1 mm,剪斷血管外的線栓,縫合切口后完成造模。SHAM組按照相同方法麻醉并暴露CCA、ECA、ICA,但不進行結(jié)扎、夾閉操作。大鼠蘇醒后參照Zea-Longa[5]法,評分1~3分為造模成功。醒腦靜組從造模后4 h開始進行藥物干預,給予醒腦靜注射液(無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司,批號:2017C9E8,5 mL/支)3 mL/kg腹腔注射,每隔半小時1次,連續(xù)3次;SHAM組和MCAO組給予生理鹽水3 mL/kg腹腔注射,每隔半小時1次,連續(xù)3次。

    1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分方法? 造模后24 h,采用Zea-Longa[5]的5分制評分法進行神經(jīng)功能缺損的評價,無神經(jīng)功能缺損為0分,左前肢不能完全伸展為1分,行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分,行走時向左側(cè)傾倒為3分,意識喪失為4分。

    1.2.3 腦缺血組織中細胞凋亡的TUNEL檢測? 完成神經(jīng)功能缺損的評價后,處死大鼠并解剖得到缺血部位的腦組織,取適量腦組織制作冰凍腦片,用TUNEL試劑盒中的TUNEL染色液和DAPI染色液進行染色后,在熒光顯微鏡的高倍視野下進行觀察,記錄凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù)后計算細胞凋亡率。

    1.2.4 腦缺血組織中基因表達的Western-blot檢測? 取缺血部位腦組織適量,加入蛋白裂解液后進行超聲勻漿,勻漿后的組織懸液在4℃離心機中以12 000轉(zhuǎn)/min的速度離心10 min,取上層澄清的蛋白樣本后加入聚丙烯酰胺分離凝膠,電泳后將蛋白樣本電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;含有蛋白樣本的PVDF膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h后孵育NF-κB、NOX4的第一抗體、4℃過夜;第2天取出PVDF膜,孵育第2抗體后用ECL顯影系統(tǒng)對NF-κB、NOX4的蛋白條帶進行顯影,計算NF-κB/GAPDH、NOX4/GAPDH的灰度值比值作為蛋白表達水平。

    1.2.5 腦缺血組織中細胞因子及氧化介質(zhì)的試劑盒檢測? 取缺血部位腦組織適量,加入磷酸鹽緩沖液后進行超聲勻漿,勻漿后的組織懸液在4℃離心機中以12 000轉(zhuǎn)/min的速度離心10 min,取上清后采用ELISA試劑盒檢測白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、細胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的含量,采用化學熒光法試劑盒檢測活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)含量,采用硫代巴比妥酸法試劑盒檢測丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,采用比色法試劑盒檢測總抗氧化力(Total antioxidant capacity,T-AOC)含量。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件錄入數(shù)據(jù),三組間計量資料的比較采用方差分析,兩兩比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 三組間神經(jīng)功能缺損評分及腦缺血組織細胞凋亡率比較

    MCAO組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分及腦缺血組織細胞凋亡率均明顯高于SHAM組,醒腦靜組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分及腦缺血組織細胞凋亡率均明顯低于MCAO組,三組間神經(jīng)功能缺損評分及細胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

    2.2 三組間腦缺血組織中炎癥反應指標比較

    MCAO組大鼠腦缺血組織中NF-κB的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1的含量均明顯高于SHAM組,醒腦靜組大鼠腦缺血組織中NF-κB的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1的含量均明顯低于MCAO組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

    2.3三組間腦缺血組織中氧化應激指標比較

    MCAO組大鼠腦缺血組織中NOX4的表達水平及ROS、MDA的含量均明顯高于SHAM組,T-AOC的含量明顯低于SHAM組;醒腦靜組大鼠腦缺血組織中NOX4的表達水平及ROS、MDA的含量均明顯低于MCAO組,T-AOC的含量明顯高于MCAO組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

    3 討論

    醒腦靜注射液是用于腦梗死[3-4]、腦出血[5]、腦外傷[6]等疾病治療的中藥注射液,其有效成分包括麝香、冰片、梔子等中藥材,能夠通過介導抗炎、抗氧化以減輕患者神經(jīng)功能的損傷。為了明確醒腦靜注射液用于腦梗死治療的價值及機制,本研究在建立MCAO大鼠模型的基礎上首先觀察了醒腦靜注射液的神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示,MCAO組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯升高、醒腦靜組大鼠的神經(jīng)功能缺損評分明顯低于MCAO組,提示醒腦靜注射液能夠改善MCAO組大鼠的神經(jīng)功能。缺血腦組織中細胞過度凋亡是引起神經(jīng)損傷的基本病理環(huán)節(jié),本研究對MCAO大鼠缺血腦組織中細胞凋亡率的分析顯示,MCAO組大鼠腦缺血組織的細胞凋亡率明顯升高,而醒腦靜組大鼠腦缺血組織的細胞凋亡率明顯低于MCAO組,提示醒腦靜注射液對MCAO大鼠缺血腦組織中的細胞凋亡具有顯著抑制作用,這一結(jié)果與醒腦靜注射液減輕MCAO大鼠神經(jīng)損傷的結(jié)果一致,共同表明醒腦靜注射液具有神經(jīng)保護作用。

    腦梗死部位炎癥反應的過度激活是引起神經(jīng)功能損傷的重要病理環(huán)節(jié)。動物實驗表明,大量炎癥細胞在腦梗死周圍浸潤[7-8]。NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應的核心轉(zhuǎn)錄因子,在生理狀態(tài)下與抑制因子I-κB結(jié)合并處于失活狀態(tài);在缺血缺氧等病理因素刺激下,NF-κB表達增多并與I-κB解離,大量游離的NF-κB進入細胞核后啟動IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1等炎癥基因的表達[9-10]。IL-1β、TNF-α具有促炎活性,能夠介導多種炎癥細胞發(fā)生活化并向炎癥部位遷移、浸潤[11-12];MMP-9具有水解蛋白質(zhì)的活性,能夠促進炎癥細胞破壞血腦屏障并在腦梗死病灶內(nèi)浸潤[13];ICAM-1具有細胞間黏附活性,能夠促進炎癥細胞向炎癥部位的黏附并放大炎癥反應[14]。本研究對MCAO模型大鼠腦缺血組織中炎癥指標的分析顯示,MCAO組大鼠腦缺血組織中NF-κB的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1的含量均明顯升高,而醒腦靜組大鼠腦缺血組織中NF-κB的表達水平及IL-1β、TNF-α、MMP-9、ICAM-1的含量均明顯低于MCAO組。這一結(jié)果表明NF-κB介導的炎癥反應在缺血腦組織中明顯激活,醒腦靜對缺血腦組織中NF-κB介導的炎癥反應具有抑制作用。

    炎癥細胞在腦梗死病灶周圍的浸潤不僅能夠通過多種炎癥介質(zhì)的釋放來介導腦組織的炎癥損傷,還能通過增加自由基的釋放來介導腦組織的氧化應激損傷。NOX4是介導自由基生成的重要催化酶,多種炎癥細胞能夠通過表達NOX4以增加自由基的釋放并引起組織發(fā)生氧化應激損傷[15-16]。ROS是重要的自由基類型,具有極強的氧化性,與細胞膜、線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等膜結(jié)構中的脂質(zhì)發(fā)生氧化反應,造成膜結(jié)構破壞的同時也生成脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA,消耗T-AOC[17-19]。本研究對MCAO模型大鼠腦缺血組織中氧化應激指標的分析顯示,MCAO組大鼠腦缺血組織中NOX4的表達水平及ROS、MDA的含量均明顯升高,T-AOC的含量明顯減少,而醒腦靜組大鼠腦缺血組織中NOX4的表達水平及ROS、MDA的含量均明顯低于MCAO組,T-AOC的含量明顯高于MCAO組。這一結(jié)果表明NOX4介導的氧化應激反應在缺血腦組織中明顯激活,醒腦靜對缺血腦組織中NOX4介導的氧化應激反應具有抑制作用。

    綜上所述,醒腦靜注射液能夠改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能并抑制腦缺血組織中NF-κB介導的炎癥反應、NOX4介導的氧化應激反應,進而表明醒腦靜注射液的神經(jīng)改善作用與神經(jīng)細胞炎癥及氧化應激損傷受抑制有關。

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    (收稿日期:2020-10-15)

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