肺心寧湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1水平的影響※

馬志娟 舒 亮 楊 爽 黃 燕

(內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院肺病科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全氣流受限為特征，以慢性咳嗽、咯痰、呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)常見病，氣道重塑是COPD氣流受限的根本原因[1]。目前，雖然COPD氣道重塑的確切發(fā)病機(jī)制尚未明了，但已有研究表明其發(fā)生發(fā)展與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡是導(dǎo)致COPD氣道重塑的重要環(huán)節(jié)之一[2]。肺心寧湯具有清熱化痰、寬中散結(jié)的功效，是我們臨床治療肺系疾病的經(jīng)驗(yàn)方[3]，先前研究表明其對(duì)于COPD模型大鼠具有良好的治療效果，可以減輕大鼠氣道炎癥，改善血管內(nèi)皮功能[4]，但肺心寧湯是否對(duì)COPD氣道重塑也有改善作用尚未得到證實(shí)。我們擬通過(guò)觀察肺心寧湯對(duì)COPD模型大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(TIMP-1)水平變化影響，探討肺心寧湯對(duì)COPD氣道重塑的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量150～160 g，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～23 ℃，濕度50%～60%，由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SAXK(蒙)2016-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及物品 肺心寧湯(藥物組成：黃連3 g，杏仁6 g，瓜蔞15 g，澤瀉6 g，半夏 9 g，茯苓9 g，枳實(shí)6 g，陳皮6 g，炙甘草3 g，由內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑室負(fù)責(zé)制成湯劑，生藥含量0.525 g/mL)；醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H33021207)；脂多糖(美國(guó)SIGMA公司)；紅梅牌香煙[紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，烤煙型]；自制有機(jī)玻璃染毒箱(長(zhǎng)×寬×高：100 cm×50 cm×50 cm，在箱體兩側(cè)均有直徑約1.5 cm的換氣孔)。

1.3 主要試劑及儀器 MMP-9酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)試劑盒及TIMP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司)；通用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-Time PCR)試劑盒(M-MLV)及內(nèi)參抗體(β-actin)(美國(guó)Promega公司)；Trizol總RNA抽提試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；Real-Time PCR儀(瑞士Roche公司)；UItra SYBR Mixture(美國(guó)Invitrogen公司)；CT15RE臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；JT-12電腦生物組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；BX53生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及模型制備 將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、醋酸潑尼松組、肺心寧湯低劑量組、肺心寧湯中劑量組及肺心寧湯高劑量組，每組10只。除正常組外，其余5組均參照文獻(xiàn)[5]中COPD的造模方法，采用煙熏加氣道內(nèi)滴入脂多糖制作COPD模型，造模周期為90 d。

1.4.2 COPD模型評(píng)價(jià) 造模結(jié)束后，各組均隨機(jī)抽取2只大鼠處死，取大鼠肺組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色做成病理切片后在生物顯微鏡下觀察，可見肺泡壁變薄、斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡，肺間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明COPD大鼠模型制作成功。見封3，圖1。

1.4.3 給藥方法 正常組及模型組按6.3 mL/kg予蒸餾水灌胃，醋酸潑尼松組按0.027 g/kg予醋酸潑尼松片藥液灌胃，肺心寧湯低、中、高劑量組分別按3.3、6.6、13.2 mL/kg予肺心寧湯藥液灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃28 d。

1.4.4 取材 各組大鼠末次灌胃24 h后腹腔麻醉并處死。剖開腹部，通過(guò)腹主動(dòng)脈采血適量，靜置30 min，以3 000 r/min離心5 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待測(cè)。打開大鼠胸腔，剝離肺組織，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈后將肺組織剪為2部分，一部分放入凍存管，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，另一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)變化 將采用多聚甲醛溶液固定的肺組織用梯度酒精脫水、浸蠟、包埋，制成石蠟塊，切片，采用HE染色法進(jìn)行染色，最后在生物顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.5.2 血清MMP-9及TIMP-1檢測(cè) 將冷凍保存的血清標(biāo)本常溫解凍后置于超凈工作臺(tái)上，均采用ELISA法對(duì)血清MMP-9及TIMP-1水平進(jìn)行檢測(cè)，相關(guān)操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5.3 肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA檢測(cè) 采用Real-Time PCR法檢測(cè)肺組織中MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA的表達(dá)情況。首先取凍存的肺組織，放入研缽中加入液氮進(jìn)行研磨，磨成粉末狀后，采用Trizol試劑盒從肺組織中提取總RNA。然后所得總RNA樣本根據(jù)45 ℃，55 min，95 ℃，5 min條件，在Real-Time PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。最后在Real-Time PCR儀上按照如下反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：預(yù)變性，95 ℃，10 min；變性，95 ℃，15 s；退火/延伸，60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照。采用2-△△CT法分析樣品間的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠灌胃后肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及病理變化 正常組大鼠肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔無(wú)擴(kuò)大，肺泡腔內(nèi)無(wú)明顯滲出，肺間隔未見增厚，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肺泡腔擴(kuò)大，肺泡壁變薄、斷裂，部分融合成肺大泡，肺間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組在灌胃干預(yù)治療后，大鼠肺組織出現(xiàn)不同程度的肺泡腔擴(kuò)大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組病理程度減輕，其中肺心寧湯高劑量組肺泡擴(kuò)張較少，肺泡結(jié)構(gòu)大致正常，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其余3組治療效果均差于肺心寧湯高劑量組。見封3，圖2。

2.2 各組大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比較 見表2。

表2 各組大鼠灌胃后血清MMP-9及TIMP-1水平比較

由表2可見，與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-9水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組血清MMP-9水平均明顯降低(P<0.05)，TIMP-1水平均明顯升高(P<0.05)。肺心寧湯各劑量組組間比較，肺心寧湯中、高劑量組血清MMP-9水平均明顯低于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，TIMP-1水平均明顯高于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組血清MMP-9及TIMP-1水平改善均優(yōu)于肺心寧湯中劑量組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠灌胃后肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況比較 見表3。

表3 各組大鼠灌胃后肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)情況比較

由表3可見，與正常組比較，模型組大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。肺心寧湯各劑量組組間比較，肺心寧湯中、高劑量組肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯低于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯高于肺心寧湯低劑量組(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組肺組織MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表達(dá)改善均優(yōu)于肺心寧湯中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

氣道重塑是以氣道慢性炎癥為發(fā)生基礎(chǔ)，是氣道炎癥慢性化發(fā)展的必然結(jié)果，包括基底膜的假性增厚、細(xì)胞外基質(zhì)的改變、平滑肌增生肥大等，研究表明COPD患者支氣管壁較正常人明顯增厚，并發(fā)生有氣道組織的結(jié)構(gòu)變化[6-7]。COPD患者發(fā)生氣道重塑與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡關(guān)系密切，正常情況下細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，對(duì)保護(hù)組織損傷起著關(guān)鍵性的作用，一旦平衡失調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度的合成或降解，都會(huì)影響到氣體交換，進(jìn)而影響氣道結(jié)構(gòu)，加重氣道纖維化，最終導(dǎo)致氣道阻塞，引起氣流受限[8-9]。因此，維持細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解平衡對(duì)延緩COPD病情的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。MMP-9及TIMP-1是干預(yù)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的關(guān)鍵因子，其水平變化常常作為反映COPD氣道重塑過(guò)程中炎癥程度與氣道修復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)[10-12]。MMP-9是一種蛋白水解酶，作為一種降解酶其不僅可以降解氣道及肺組織細(xì)胞外基質(zhì)成分，使肺泡腔擴(kuò)大，肺泡彈性回縮能力減弱，從而導(dǎo)致氣流滯留，還可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集，破壞上皮和內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，加重炎性反應(yīng)，且其活性程度與COPD呼吸受限程度呈正比[13-14]。TIMP-1是MMP-9特異性的抑制酶，其可與MMP-9催化位點(diǎn)結(jié)合形成聚合物，通過(guò)降低MMP-9的活性來(lái)抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，減少降解產(chǎn)物在黏膜下層聚集，此外TIMP-1還具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的生長(zhǎng)因子樣作用，促進(jìn)組織修復(fù)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠灌胃后血清MMP-9水平及肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺組織TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。說(shuō)明造模后模型組發(fā)生氣道重塑。

COPD屬中醫(yī)學(xué)喘證、咳嗽、肺脹等范疇。《靈樞·五閱五使》言：“肺病者，喘息鼻張?！薄鹅`樞·脹論》言：“肺脹者，虛滿而喘咳?！薄督饏T要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治》言：“咳而上氣，此為肺脹，其人喘，目如脫狀。”中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，COPD發(fā)病主要與肺、脾二臟相關(guān)，脾為生痰之源，肺為貯痰之器，外邪犯肺，肺氣失宣，又脾氣不足，運(yùn)化失司，聚濕為痰，郁久化熱，痰液熏蒸，痰火交阻于肺，肺失宣降，上逆為喘?！短绞セ莘健分杏涊d：“邪氣與正氣相搏，不得宣通，胸中痞塞，痰飲留滯，喘息短氣，晝夜常嗽，不得睡臥也。”我們所用肺心寧湯是由經(jīng)典名方小陷胸湯化裁而來(lái)，方中瓜蔞清熱化痰，寬胸散結(jié)，以通胸膈之痹；黃連配伍半夏，寒熱并用，辛開苦降，泄熱除痞，化痰散結(jié)；陳皮、枳實(shí)燥濕化痰，行氣健脾；茯苓淡滲利濕；杏仁宣肺平喘；澤瀉健脾寧心，利水滲濕；甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，使痰熱得以消散，肺氣得以宣降，具有健脾燥濕、清熱化痰、宣肺理氣、寬中散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，小陷胸湯合抵當(dāng)湯可能通過(guò)降低肺纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)含量而發(fā)揮治療肺纖維化作用[17]；瓜蔞中的氨基酸能減少炎性分泌物的分泌，從而發(fā)揮抗炎的作用[18]；半夏中提取的總生物堿可延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，起到鎮(zhèn)咳祛痰的作用[19]；陳皮中揮發(fā)油可擴(kuò)張支氣管，改善氣流受限[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)相應(yīng)灌胃干預(yù)治療后，與模型組比較，醋酸潑尼松組及肺心寧湯低、中、高劑量組血清MMP-9水平及肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，血清TIMP-1水平及肺組織TIMP-1 mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，且肺心寧湯高劑量組改善效果均優(yōu)于肺心寧湯中、低劑量組(P<0.05)，說(shuō)明肺心寧湯的治療效果與醋酸潑尼松一致，并存在一定的量效關(guān)系。

綜述所述，肺心寧湯對(duì)于COPD大鼠具有確切的治療作用，其作用機(jī)制可能為降低血清MMP-9水平，升高TIMP-1水平，抑制肺組織MMP-9 mRNA表達(dá)，促進(jìn)TIMP-1 mRNA表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)氣道重塑過(guò)程，改善肺組織病理?yè)p傷，延緩病情進(jìn)展，且其對(duì)COPD的改善作用與劑量呈正相關(guān)。